LRP5基因與LRP6基因的交互作用及其與冠心病PCI預(yù)后研究

方翔，李長(zhǎng)嶺，孫勇

流行病學(xué)與循征醫(yī)學(xué)資料證實(shí)，高脂血癥是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。?、腦梗死、心肌梗死等獨(dú)立而重要的危險(xiǎn)因素，并與這些疾病的患病率和病死率密切相關(guān)[1]。近來(lái)發(fā)現(xiàn)多種基因變異與原發(fā)性高脂血癥相關(guān)[2]。有研究表明低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP）6基因的突變可致血漿低密度脂蛋白和三酰甘油增高[3-5]，高血壓、糖尿病和骨質(zhì)疏松的發(fā)生率增加，而LRP5基因與LRP6基因的交互作用與冠心病的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)性[6]。本研究選擇2011年6月～2014年6月因冠心病行冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)（PCI術(shù)）的患者為研究對(duì)象，研究LRP5基因與LRP6基因的交互作用與冠心病PCI術(shù)后預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 入選2011年6月～2014年6月于四川省達(dá)州市第二人民醫(yī)院因冠心病行PCI治療的患者600例（PCI組），對(duì)照組為同期行冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果陰性的患者600例。所有PCI患者均通過(guò)冠狀動(dòng)脈造影確診，存在一支或一支以上主要冠狀動(dòng)脈血管狹窄，管腔狹窄度≥75%，置入支架均為雷帕霉素藥物涂層支架。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往PCI或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)史；②既往前壁心肌梗死或心功能不全患者；③患者存在管腔狹窄度≥75%的病變而不能進(jìn)行PCI治療，未行完全血運(yùn)重建；④2型糖尿??；⑤肝腎功能不全患者；⑥缺血性或出血性腦血管疾病等疾??；⑦抑郁狀態(tài)或抑郁癥病史。所有參與人員均知情同意，并簽署書面知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1一般項(xiàng)目及生化指標(biāo)測(cè)定 入選患者空腹測(cè)量身高、體重，計(jì)算體質(zhì)指數(shù)BMI（kg/m2）。測(cè)量臥位雙上肢血壓，取其平均值。詳細(xì)詢問(wèn)患者的吸煙史及家族史并記錄。空腹抽取靜脈血3 ml，立即送檢，采用全自動(dòng)血液生化分析儀進(jìn)行血糖、血脂、血肌酐、同型半胱氨酸和高敏C反應(yīng)蛋白水平檢測(cè)，所用生化試劑均由羅氏公司提供。

1.2.2 DNA分析 從HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.hapmap.org）入選了與冠心病相關(guān)9個(gè)LRP6單核苷酸基因多態(tài)性和2個(gè)LRP5單核苷酸基因多態(tài)性，入選標(biāo)準(zhǔn)為最小等位基因頻率＞0.10。LRP6單核苷酸基因多態(tài)性分別命名為SNP6-1（rs2160525），SNP6-2（rs2284396），SNP6-3（rs4477532），SNP6-4（rs2302685），SNP6-5（rs7305037），SNP6-6（rs12823243），SNP6-7（rs1181333），SNP6-8（rs11054731）和SNP6-9（rs17848270）；LRP5單核苷酸基因多態(tài)性命名為SNP5-1（rs41494349），SNP5-2（rs3736228）。采用QIAamp DNA 提取試劑盒從患者血液中提取基因組DNA（凱杰公司，瓦倫西亞，美國(guó)），TaqMan方法測(cè)定SNP基因型（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，福斯特市，美國(guó)）。PCR反應(yīng)的總體積為50 L，在PE7000 進(jìn)行檢測(cè)時(shí)所需反應(yīng)條件為：93℃，預(yù)變性2 min；93℃，變性30 s；60.5℃退火1 min，72℃延伸30 s，循環(huán)40 次，在4℃下進(jìn)行保存。

1.2.3 隨訪 對(duì)所有入組者進(jìn)行隨訪1年，隨訪期間發(fā)生如下情況為陽(yáng)性心血管事件：①急性心肌梗死；②冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)的支架內(nèi)再狹窄；③冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)非干預(yù)血管進(jìn)展至管腔狹窄度大于75%；④因心絞痛住院，心電圖符合典型缺血性ST-T改變；⑤證實(shí)的心源性猝死。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用卡方檢驗(yàn)評(píng)估相關(guān)性和哈迪-溫伯格平衡定律。采用SNPlyze5.1pro版本軟件包對(duì)連鎖不平衡和單體型進(jìn)行分析（包括置換檢驗(yàn)）。采用最大期望算法對(duì)單倍型估計(jì)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。并對(duì)LRP6和LRP5基因單核苷酸多態(tài)性和冠心病PCI術(shù)后心血管事件發(fā)生二階偏最小二乘路徑模型（PLS-PM模型）進(jìn)行分析，PLS-PM模型屬于迭代算法，第一步在測(cè)量模型中解決潛變量與顯變量之間的關(guān)系，第二步在結(jié)構(gòu)模型中估計(jì)潛變量之間的路徑系數(shù)。采用SAS 5.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般項(xiàng)目及生化指標(biāo)測(cè)定 兩組患者空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、血肌酐、高敏C反應(yīng)蛋白和同型半胱氨酸比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表1。

2.2 LRP6和LRP5與冠心病PCI術(shù)后心血管事件發(fā)生的相關(guān)性 通過(guò)Pearson相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)LRP6的3個(gè)SNPs（SNP6-1，SNP6-2，SNP6-7）與冠心病PCI術(shù)后心血管事件發(fā)生存在相關(guān)性，而且SNP6-7和心血管事件發(fā)生具有強(qiáng)相關(guān)性。LRP5的2個(gè)SNPs（SNP5-1，SNP5-2）與冠心病PCI術(shù)后心血管事件的發(fā)生無(wú)明顯相關(guān)性，表2。

2.3 LRP5基因和LRP6基因的交互作用與冠心病PCI術(shù)后心血管事件的關(guān)聯(lián) PLS-PM模型分析顯示，LRP5-LRP6路徑系數(shù)在病例組和對(duì)照組的差異具有顯著性（P＜0.05）。此外，采用PLSPM模型來(lái)檢驗(yàn)兩個(gè)基因之間的交互作用顯示，LRP5基因和LRP6基因的交互作用與冠心病PCI術(shù)后心血管事件存在關(guān)聯(lián)性，即LRP6基因和LRP5基因的兩個(gè)路徑系數(shù)在病例組和對(duì)照組的差異具有顯著性（P＜0.05），表3～4。

3 討論

冠心病是嚴(yán)重威脅居民健康的一類心臟疾患。隨著基因組學(xué)研究的進(jìn)展，尤其近年來(lái)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的提出[7]，基因多態(tài)性與冠心病的發(fā)生密切相關(guān)，因其對(duì)冠心病的發(fā)生、進(jìn)展和不同治療手段的反應(yīng)明顯，因此尋找相關(guān)基因的多態(tài)性與冠心病預(yù)后事件間的關(guān)聯(lián)意義重大。多數(shù)研究認(rèn)為PCI僅在改善患者的血管狹窄狀況、緩解心絞痛方面有明顯療效，而不能從根本上改善患者的疾病狀態(tài)，而且PCI術(shù)后冠狀動(dòng)脈病變依然會(huì)有明顯進(jìn)展[8,9]。對(duì)于基因組的研究有望提供精準(zhǔn)化治療，從根本上改善預(yù)后。

表1 兩組患者基線情況對(duì)比

表2 LRP6和LRP5與PCI術(shù)后心血管事件發(fā)生的相關(guān)性分析

表3 LRP6基因和LRP5基因的交互性

復(fù)雜疾病的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，它存在基因與基因、基因與環(huán)境之間交互作用，暗示了它們?cè)谥虏⌒?yīng)上的協(xié)同性，這種協(xié)同性特征在易感人群中表現(xiàn)為它們的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)性，即存在著高度的相關(guān)性或依賴性。LRP5基因與LRP6基因有71%的同源性，它們編碼的兩個(gè)蛋白屬于Wnt配體的共同受體，在經(jīng)典的信號(hào)通路中起重要作用。LRP5基因與LRP6基因編碼的蛋白在動(dòng)脈粥樣硬化炎癥發(fā)展過(guò)程當(dāng)中起著重要作用，都是通過(guò)一定機(jī)制來(lái)導(dǎo)致血脂異常，進(jìn)而構(gòu)成冠心病發(fā)病的生物環(huán)節(jié)。

LRP5基因與LRP6基因?qū)儆诘兔芏戎鞍资荏w家族的成員，兩者有同源性，其編碼的兩種蛋白均屬于Wnt配體的共同受體，均在經(jīng)典的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要作用[10,11]。LRP5基因突變可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥-假神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合征或者人群中的高骨密度癥，同時(shí)高脂飲食喂養(yǎng)的LRP5基因缺陷小鼠會(huì)導(dǎo)致血膽固醇過(guò)多和葡萄糖耐受性受損，而LRP6基因則是動(dòng)脈粥樣硬化的易感基因。既往研究表明LRP5基因與LRP6基因的交互作用與冠心病的發(fā)生存在相關(guān)性[12]，本研究也發(fā)現(xiàn)SNP6-1，SNP6-2，SNP6-7與冠心病PCI術(shù)后心血管事件發(fā)生存在相關(guān)性，且SNP6-7和心血管事件發(fā)生具有強(qiáng)相關(guān)性。LRP5的單核苷酸基因多態(tài)性與冠心病PCI術(shù)后心血管事件的發(fā)生無(wú)明顯相關(guān)性，而LRP5基因和LRP6基因的交互作用與冠心病存在關(guān)聯(lián)性。研究表明LRP6基因R611C可引起高脂血癥[13]，本研究亦證實(shí)了LRP6基因多態(tài)性與冠心病PCI術(shù)后患者的心血管事件發(fā)生具有相關(guān)性。目前關(guān)于LRP6基因多態(tài)性的研究有一定的進(jìn)展，但是LRP6基因多態(tài)性以及LRP5基因和LRP6基因的交互作用在冠心病PCI術(shù)后患者病理生理發(fā)生過(guò)程中的確切機(jī)制及地位還需進(jìn)一步證實(shí)。

當(dāng)前動(dòng)脈粥樣硬化的基因治療方面的研究還主要在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。主要的研究方法是通過(guò)有治療作用的目的基因轉(zhuǎn)入患者相關(guān)器官或組織中，然后目的基因在體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行適度的表達(dá)，以期達(dá)到治療或延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的目的。尋找新的治療基因、更理想的基因載體、更安全有效的基因轉(zhuǎn)移途徑仍然是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)，而與其它傳統(tǒng)或新興的治療手段的結(jié)合也將是基因治療在臨床應(yīng)用的重要方式。LRP5基因和LRP6基因以及兩基因的交互作用與冠心病、冠心病PCI術(shù)后心血管事件的發(fā)生存在相關(guān)性，有望成為冠心病基因治療的靶基因。

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