經(jīng)顱超聲輔助溶栓技術(shù)在缺血性腦卒中動(dòng)物模型的應(yīng)用

朱曉霞，周琛云，周潔宏，唐琳，周裕卿，馬朗，羅燕，閻鋒*

(1. 四川大學(xué)華西醫(yī)院超聲科，成都 610041； 2. 四川大學(xué)華西醫(yī)院超聲影像藥物研究室，成都 610041)

缺血性腦卒中是由大腦血管閉塞，引起局部腦組織供血不足，最終導(dǎo)致腦梗死、神經(jīng)功能障礙的一種嚴(yán)重急癥，具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)[1-3]。早期快速的溶栓治療能夠挽救患者生命，恢復(fù)腦細(xì)胞的生理功能[4-5]。重組組織型纖溶酶原激活劑(rtPA)是目前唯一被FDA認(rèn)證用于急性腦缺血溶栓治療的靜脈注射藥物，但其較窄的治療時(shí)間窗、出血性并發(fā)癥一直是其臨床應(yīng)用的瓶頸[6]。由于時(shí)間窗的限制(﹤4.5 h)，rtPA的臨床治療的適用率在美國(guó)僅在5%左右。在中國(guó)，6 h內(nèi)靜脈注射尿激酶(urokinase, UK)是治療超早期腦卒中的主要溶栓方案[7]。由于各種原因，我國(guó)卒中患者的溶栓率僅在1.6%～4%[8]。因此，卒中治療急需尋找一種及時(shí)、安全和有效的治療方法或手段。

超聲溶栓是一種采用物理手段輔助溶栓的方法。超聲溶栓根據(jù)超聲頻率和強(qiáng)度的不同，分為低頻高強(qiáng)度超聲和高頻低強(qiáng)度超聲。低頻高強(qiáng)度超聲(﹤1 MHz)的優(yōu)點(diǎn)是顱腦的穿透性強(qiáng)，但缺點(diǎn)是易產(chǎn)生不穩(wěn)定空化效應(yīng)，導(dǎo)致腦內(nèi)出血風(fēng)險(xiǎn)[9]。目前國(guó)外的研究主要采用高頻率(1～2 MHz)、低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡來進(jìn)行輔助溶栓[10-14]。同時(shí)經(jīng)顱超聲溶栓根據(jù)溶栓過程中是否需要溶栓藥物或微泡進(jìn)行聯(lián)合溶栓，又分為以下四種方法：超聲波直接輻照血栓溶栓、超聲聯(lián)合溶栓藥物溶栓、超聲聯(lián)合微泡溶栓、超聲聯(lián)合微泡及溶栓藥物溶栓[15]。

盡管超聲溶栓已應(yīng)用于臨床試驗(yàn)以及卒中患者康復(fù)。但其安全性和有效性任未得到廣泛認(rèn)可。因此本文對(duì)經(jīng)顱超聲溶栓技術(shù)的作用機(jī)制以及在動(dòng)物缺血性卒中模型近十余年來的研究進(jìn)行總結(jié)，希望為將來的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)及應(yīng)用提供參考。

1 超聲溶栓原理

1.1 超聲聯(lián)合溶栓藥物的溶栓機(jī)理

超聲溶栓的主要原理為超聲波在組織內(nèi)傳播時(shí)產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)，增加溶栓藥物向血栓內(nèi)部的滲透及轉(zhuǎn)運(yùn)，增加藥物與血栓的作用面積，增強(qiáng)溶栓藥物與纖維蛋白的結(jié)合能力，輔助溶栓藥物切斷血栓纖維內(nèi)的分子連接，從而加快纖維蛋白基質(zhì)的降解，縮短血管再通時(shí)間，提高溶栓的成功率。超聲輔助溶栓還可減少溶栓藥物的使用劑量，進(jìn)而降低溶栓藥物導(dǎo)致的出血風(fēng)險(xiǎn)[16-17]。

1.2 微泡增強(qiáng)溶栓的機(jī)理

微泡(microbubbles，MB)型超聲造影劑(例如聲諾維，SonoVue)是一種含有穩(wěn)定惰性氣核及磷脂外殼微米級(jí)氣泡。其平均直徑約2 μm，小于人體紅細(xì)胞。微泡造影劑經(jīng)靜脈注射后可隨血液循環(huán)到達(dá)人體各器官組織但不逸出于血管。當(dāng)受到超聲激勵(lì)時(shí)，微泡會(huì)隨著聲波周期性壓力變化發(fā)生有規(guī)律的膨脹與收縮，在血液里形成穩(wěn)定的空化核，可降低單獨(dú)由超聲波機(jī)械振動(dòng)產(chǎn)生的空化效應(yīng)的閾值(能量)，增強(qiáng)溶栓藥物對(duì)血栓的滲透和擴(kuò)散作用從而避免了溶栓藥物在體內(nèi)半衰期短的問題，提高了藥物的溶栓效果及安全性[18]。

血栓靶向微泡是利用血栓形成時(shí)激活的血小板表面會(huì)表達(dá)高密度的血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受體，人為將其靶向配體(蛋白質(zhì)、抗體、肽類等)連接到微泡表面，使微泡能識(shí)別GPⅡb/Ⅲa 等血栓受體，從而能與血栓表面或內(nèi)部靶點(diǎn)受體分子特異性結(jié)合并積聚，增強(qiáng)微泡與血栓之間的相互作用[19]。因此采用具有特異性的靶向微泡可進(jìn)一步增加超聲溶栓的有效性。

2 經(jīng)顱超聲在缺血性腦卒中動(dòng)物模型中的溶栓研究

2.1 超聲聯(lián)合尿激酶在缺血性腦卒中動(dòng)物模型的應(yīng)用

尿激酶靜脈溶栓是我國(guó)治療超早期腦梗死的主要方法之一[7]。劉巍松等[20]研究證明超聲可增強(qiáng)尿激酶在新西蘭白兔腦血栓的溶栓效果，促進(jìn)血栓溶解，使缺血腦組織及時(shí)得到血流再灌注，從而保障神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損及時(shí)的恢復(fù)。畢建中等[21]在研究超聲輔助尿激酶治療急性腦梗死大鼠的溶栓效果時(shí)，發(fā)現(xiàn)低頻超聲(頻率800 kHz、聲強(qiáng)1.2 W/cm2，占空比1∶5)加小劑量尿激酶組(1萬單位)輻照30 min 后，大鼠神經(jīng)系統(tǒng)功能較治療前明顯改善，與單獨(dú)應(yīng)用大劑量尿激酶的實(shí)驗(yàn)組無差異。實(shí)驗(yàn)表明超聲不僅增強(qiáng)尿激酶溶栓作用，還可減少尿激酶用量，降低腦出血的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超聲對(duì)顱骨和腦組織無損傷。

2.2 超聲聯(lián)合 rtPA在動(dòng)物缺血性腦卒模型的應(yīng)用

Daffertshofer 等[22]在大鼠自體血栓腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)rtPA溶栓效果相比，超聲(27.5 kHz, 0.6 W/cm2, 20% DC)聯(lián)合rtPA可明顯減少腦梗死體積(26% vs. 11%)，證明超聲能增強(qiáng)rtPA溶栓效果。 Saguchi 等[17]在Wistar大鼠注射rtPA后用US(490 kHz, 0.8 W/cm2, MI 0.22)間斷累計(jì)照射32 min后，發(fā)現(xiàn)與rtPA對(duì)照組相比，超聲組的大鼠神經(jīng)功能修復(fù)明顯好于對(duì)照組(P=0.008)，溶栓率增高(P=0.041)，腦梗死體積也明顯減少(P=0.047)。

3 經(jīng)顱超聲聯(lián)合微泡在動(dòng)物缺血性腦卒中模型的溶栓應(yīng)用

3.1 經(jīng)顱超聲聯(lián)合微泡在兔缺血性腦卒中模型的應(yīng)用

Culp 等[10]比較了US聯(lián)合不同微泡(lipid MB、3 μm MB、tagged 3 μm MB)、US聯(lián)合rtPA、rtPA等5種治療方案在自體血栓建立新西蘭白兔缺血性腦卒中模型溶栓效果。結(jié)果，lipid MB + US、3μm MB + US、tagged 3 μm MB + US三組的24 h腦梗死體積顯著小于空白對(duì)照(無藥物或超聲干預(yù))組(1.0%±0.6%、0.7%±0.9%、0.8%±0.8% vs 3.5%±0.8%，P< 0.05)。 rtPA(2.2%±0.6%)與 rtPA+US組的梗死體積(1.7%±0.8%)之間差異無顯著性(P> 0.05)。該實(shí)驗(yàn)證明超聲聯(lián)合微泡即便在不使用溶栓藥物時(shí)，也可以有效地減小腦梗死體積，其有效性甚至略高于超聲聯(lián)合rtPA時(shí)的溶栓效果。 Brown 與 Flores 等[11, 23]在兔大腦中動(dòng)脈血栓梗塞模型中，均證實(shí)超聲聯(lián)合微泡不僅可以減小梗死體積，還能夠顯著的降低腦梗死區(qū)外的出血。Liu等[19]比較了尿激酶和尿激酶聯(lián)合超聲微泡溶栓效果，結(jié)果尿激酶組溶栓效果差于尿激酶聯(lián)合超聲微泡組(再通率為31.3%、梗死率為13.9%vs. 再通率為56.3%、梗死率為9.1%)。HE檢查兩組動(dòng)物大腦均未發(fā)現(xiàn)腦出血，證實(shí)尿激酶聯(lián)合超聲微泡溶栓的有效性和安全性。

Ren 等[24]發(fā)現(xiàn)兔自體血腦卒中模型梗塞6 h后低頻超聲(PW 0.8 MHz，2.787 W/cm2，20% DC，30 min)聯(lián)合動(dòng)脈注射微泡溶栓效果好于靜脈注射。Wang等[25]將血栓靶向微泡分別通過靜脈或動(dòng)脈途徑注入兔自體血栓模型，并用低頻超聲(800 kHz, 2.4 w/cm2, pulse-wave)進(jìn)行輻照溶栓，發(fā)現(xiàn)靶向微泡在兩種途徑下的超聲溶栓效果均好于非靶向微泡。

3.2 經(jīng)顱超聲聯(lián)合微泡在豬缺血性腦卒中模型的應(yīng)用

Culp等[12]用1 MHz脈沖波聯(lián)合人體白蛋白氟碳微泡輻照自體血栓建立的豬腦缺血模型，發(fā)現(xiàn)血栓溶解度及血流速度顯著高于生理鹽水對(duì)照組。此后Culp等[13]采用靶向血栓拮抗藥物依替巴肽制備的微泡聯(lián)合低頻超聲(1 MHz，2.0 W/cm2)對(duì)豬自體血腦缺血模型行超聲溶栓。結(jié)果表明，靶向微泡聯(lián)合超聲組溶栓效果顯著好于依替巴肽對(duì)照組及生理鹽水對(duì)照組(P=0.007，P=0.02)。由此可見在沒有溶栓藥物的作用下，低頻超聲聯(lián)合靶向微泡也可以對(duì)豬腦缺血模型進(jìn)行有效的溶栓。

3.3 經(jīng)顱超聲聯(lián)合微泡在大鼠缺血性腦卒中模型的應(yīng)用

臨床研究報(bào)告表明，與血管再通相比，再灌注的好壞是一個(gè)更好的預(yù)測(cè)急性缺血性卒中臨床預(yù)后的重要指標(biāo)[26-27]。Schleicher等[28]比較了無藥物及超聲干預(yù)的空白對(duì)照組、rtPA組、rtPA聯(lián)合超聲微泡組對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈梗塞1.5 h模型溶栓效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rtPA聯(lián)合超聲微泡不僅能促進(jìn)大血管的完全再通，還能促進(jìn)微循環(huán)的改善，為腦缺血再通后持續(xù)低灌注患者提供新的治療方案。同時(shí)HE染色發(fā)現(xiàn)rtPA+超聲+BR38 微泡組大腦梗死體積明顯小于空白對(duì)照組(P=0.044)。同時(shí)Lu 等[29]用自體血制備的70 μm和100 μm的富含紅細(xì)胞(或血小板)的微栓子，經(jīng)右側(cè)頸動(dòng)脈注射24 h后，大鼠形成大腦皮質(zhì)層(小部分皮質(zhì)下區(qū)域)梗死灶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲聯(lián)合微泡(US+MB)和超聲微泡聯(lián)合rtPA(US + MB + rtPA)的梗死體積和神經(jīng)評(píng)分顯著小于對(duì)照組(P< 0.01)。由此證明微泡介導(dǎo)的超聲溶栓能夠溶解富含紅細(xì)胞(或血小板)的微血栓，促進(jìn)閉塞微血管再通，減輕腦損傷。

4 總結(jié)

本文對(duì)近十余年來的動(dòng)物缺血性卒中模型研究進(jìn)行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)已報(bào)道的臨床前動(dòng)物經(jīng)顱超聲溶栓研究主要在大鼠(Wistar、SD)，新西蘭白兔體內(nèi)研究較多。在大鼠自體血超聲溶栓的研究中，絕大多數(shù)動(dòng)物研究都是從頸外動(dòng)脈注入血栓到大腦中動(dòng)脈。在新西蘭白兔中，大多數(shù)是從頸內(nèi)動(dòng)脈注入。但對(duì)各研究進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)每個(gè)研究不僅實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)參數(shù)不同，而且最后溶栓效果參數(shù)也不相同，各項(xiàng)研究很難進(jìn)行溶栓效果相互比較。因此，超聲溶栓還存在以下幾個(gè)問題需要更加系統(tǒng)、深入和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯亢徒鉀Q：

4.1 優(yōu)化超聲溶栓的參數(shù)和條件

體外實(shí)驗(yàn)證明在不同參數(shù)的超聲作用下，微泡濃度和體積會(huì)發(fā)生變化，可能也會(huì)影響溶栓的效果[30]。Auboire等[31]對(duì)國(guó)外超聲溶栓的動(dòng)物研究進(jìn)行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)各研究使用的超聲參數(shù)以及評(píng)價(jià)方法相差很大，缺乏一致性，與本文總結(jié)國(guó)內(nèi)外研究結(jié)論相同。同時(shí)雖然動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明超聲輔助溶栓有效且并未增加出血風(fēng)險(xiǎn)，但在臨床應(yīng)用中卻得到相反的結(jié)果。這可能與動(dòng)物卒中模型和臨床患者之間存在較大差別相關(guān)[32]。例如顱內(nèi)出血是急性缺血性腦卒中rtPA溶栓過程中一個(gè)嚴(yán)重的并發(fā)癥[23]。Stroick 等[14]在大鼠腦出血模型的研究中證實(shí)SonoVue微泡聯(lián)合診斷超聲是不會(huì)增加顱內(nèi)出血。但Daffertshofer 等[9]在300 KHz低頻超聲聯(lián)合rtPA溶栓Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)中，超聲+ rtPA 組出血率(13/14)遠(yuǎn)高于rtPA 組(5/12)。其可能的原因之一是超聲波在人腦顱骨內(nèi)傳播是能產(chǎn)生駐波，其峰值的疊加可能導(dǎo)致超聲溶栓時(shí)出血風(fēng)險(xiǎn)。因此，Baron等[33]認(rèn)為通過模擬計(jì)算來設(shè)計(jì)和優(yōu)化超聲溶栓參數(shù)，避免生成駐波在缺血性卒中治療方案中是非常重要的。綜上所述還需要對(duì)超聲參數(shù)和條件進(jìn)行摸索。

4.2 血栓類型

腦卒中臨床治療的難點(diǎn)之一是個(gè)體差異性很大，不僅體現(xiàn)在患者的時(shí)間窗不同，腦血管及腦組織的異質(zhì)性，側(cè)枝循環(huán)的功能差異，還存于梗死血管的血栓來源及組成成份的不同導(dǎo)致目前臨床rtPA溶栓效果存在差異[34]。相比紅色血栓，白色血栓要更為致密，并隨著血栓凝齡的增加其內(nèi)部血小板固縮導(dǎo)致血栓結(jié)構(gòu)更為緊密，將更難被溶栓劑或超聲微泡所溶解?；诖?，Lu[29]比較了大鼠自體白色血栓和紅色血栓經(jīng)顱超聲溶栓效果，發(fā)現(xiàn)在白色栓子組中超聲+微泡組與超聲+微泡+ rtPA 組梗死體積和神經(jīng)評(píng)分均顯著小于rtPA組(P<0.05)；而在紅色栓子治療組中，rtPA組與超聲+微泡組的梗死體積和神經(jīng)評(píng)分基本相同，超聲+微泡+ rtPA 組梗死體積和神經(jīng)評(píng)分顯著小于rtPA組(P< 0.05)。上述結(jié)果說明超聲溶栓的效率與血栓類型相關(guān)。目前在大多數(shù)臨床前動(dòng)物溶栓模型中，制備同類血栓的方法差異也很大，因此很難對(duì)不同研究溶栓效果進(jìn)行比較[5, 35]。

4.3 靶向微泡在超聲溶栓中的研發(fā)

目前還沒有臨床卒中治療專用溶栓特異性的微泡，臨床所使用的微泡均為診斷用的微泡。Wang等[25]用血栓靶向微泡進(jìn)行溶栓時(shí)發(fā)現(xiàn)，無論是經(jīng)動(dòng)脈或靜脈注射的靶向微泡，其超聲溶栓效果均好于非靶向微泡。但Culp 等[10]用全氟丙烷脂質(zhì)微泡(Definity)、白蛋白微泡、含有依替巴肽(糖蛋白2b3a抑制劑)及人體D二聚體纖維蛋白降解產(chǎn)物單克隆抗體的靶向白蛋白微泡三種不同類型的微泡聯(lián)合超聲進(jìn)行超聲溶栓，發(fā)現(xiàn)靶向白蛋白微泡并沒有表現(xiàn)出更高的溶栓效率。因此，靶向微泡可為攜帶溶栓藥物或基因針對(duì)病變部位進(jìn)行靶向治療，有待大規(guī)模動(dòng)物模型研究。

4.4 超聲溶栓是否會(huì)開放血腦屏障

研究表明超聲聯(lián)合微泡能打開血腦屏障，可用于大分子藥物的傳遞[36]。然而在缺血性卒中治療中，超聲溶栓可能會(huì)導(dǎo)致血腦屏障破壞和顱內(nèi)出血性轉(zhuǎn)化的機(jī)率增加[37-38]。因此，優(yōu)化超聲參數(shù)、溶栓藥物以及微泡的劑量，探索減輕溶栓并發(fā)癥以及延長(zhǎng)溶栓治療時(shí)間窗對(duì)超聲溶栓的臨床轉(zhuǎn)化具有重要的意義。

4.5 不同腦缺血部位超聲溶栓結(jié)果不同

2004年，Alexandrov等[39]用2 MHz超聲聯(lián)合rtPA的方法，對(duì)64位大腦中動(dòng)脈閉塞患者行經(jīng)顱超聲溶栓治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)顱超聲溶栓治療后2 h，治療組中動(dòng)脈完全再通和臨床恢復(fù)率顯著高于對(duì)照組(P=0.02)。但治療后24 h及3個(gè)月后再進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，治療組臨床恢復(fù)率與對(duì)照組相比差異無顯著性(P> 0.05)。這一結(jié)果表明2 MHz超聲雖然能加快大腦中動(dòng)脈的完全再通，卻并沒有顯著地改善大腦中動(dòng)脈閉塞患者的臨床預(yù)后。而同年，Alexandrov 等[40]在一個(gè)多中心隨機(jī)臨床研究(Clotbust Trial)的1期結(jié)果顯示，對(duì)大腦前動(dòng)脈閉塞的56位患者采用同樣的2 MHz診斷用超聲波持續(xù)監(jiān)測(cè)，顯示在梗塞后24 h行超聲聯(lián)合rtPA溶栓治療是安全有效的。鑒于目前多數(shù)超聲溶栓臨床前研究?jī)H限于大腦中動(dòng)脈梗塞模型，我們還需研究不同部位血栓模型。

4.6 超聲溶栓是否存在時(shí)間窗

目前動(dòng)物經(jīng)顱超聲溶栓研究中，通常是在建模后即刻溶栓，因此血管再通后的出血風(fēng)險(xiǎn)或再灌注損傷較小。但需要指出的是，缺血時(shí)間的長(zhǎng)短與腦損傷的程度有著極大的關(guān)系[41]。在臨床，溶栓藥物rtPA與尿激酶的使用均有嚴(yán)格的治療時(shí)間窗。因此，我們認(rèn)為超聲溶栓的研究除了考慮實(shí)驗(yàn)參數(shù)及方案，還應(yīng)該考慮建模后梗塞的時(shí)間即超聲溶栓是否存在時(shí)間窗的問題。

綜上所述，動(dòng)物經(jīng)顱超聲溶栓技術(shù)無論是在動(dòng)物模型的構(gòu)建還是血栓的制備，超聲參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化，溶栓效果和安全性的評(píng)估都需要大量的臨床前研究。只有全面、系統(tǒng)的研究，獲取詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，把握超聲溶栓的各種機(jī)理，才可能最終使超聲溶栓從動(dòng)物模型走向臨床應(yīng)用。