基于人源化免疫重建的患者來(lái)源腫瘤組織異種移植模型的研究進(jìn)展

趙寧寧，張正，王彥博，師長(zhǎng)宏*

(第四軍醫(yī)大學(xué) 1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心； 2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院四大隊(duì), 西安 710032)

PDX(patient-derived xenograft, PDX)模型由于缺乏免疫系統(tǒng)不能用于腫瘤免疫反應(yīng)方面的研究，完整的該模型在傳代中人的基質(zhì)成分會(huì)逐漸被小鼠代替，腫瘤基因分子異質(zhì)性不能長(zhǎng)久保持，在藥物靶向治療及腫瘤發(fā)生機(jī)制研究方面具有一定的局限性[1-2]。而將人的造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSCs)移植于X線照射的重度免疫缺陷小鼠，然后再將患者的瘤組織移植于該小鼠建立人源化腫瘤模型(humanized patient-derived xenograft, Hu-PDX)，可以給腫瘤提供與人體更相似的生長(zhǎng)環(huán)境，同時(shí)，腫瘤基質(zhì)包含了人的免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子等成分，在腫瘤靶向治療與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移機(jī)制研究方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，尤其在研究腫瘤免疫治療方面，是更理想的腫瘤模型[3-5]。本文將對(duì)Hu-PDX模型的研究進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)的闡述。

1 Hu-PDX模型的建立方法

Hu-PDX模型的建立分兩大部分：(1)免疫系統(tǒng)人源化小鼠(humanized immune system mice, HISM)。常用免疫系統(tǒng)重建方法有三種：一種是將人的骨髓、肝、胸腺組織共移植于小鼠體內(nèi)(bone marrow-liver-thymus, BLT)，這種模型雖然免疫重建效果較好，但是免疫重建材料來(lái)源有限，且對(duì)患者的創(chuàng)傷很大，不適宜用作臨床患者個(gè)體化治療的研究[1]；還有一種方法是將人的外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)移植于小鼠體內(nèi)，這種方法操作簡(jiǎn)單，且可獲得較大量的細(xì)胞，但是移植的PBMCs產(chǎn)生的人類(lèi)白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)限制了小鼠體內(nèi)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的產(chǎn)生，而且移植后4周左右小鼠會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease, GVHD)，從而限制了利用模型做實(shí)驗(yàn)的時(shí)間；將人血CD34+HSCs(使用免疫磁珠方法從PBMCs中分離)移植于免疫缺陷小鼠體內(nèi)是目前制備Hu-PDX模型較常采用的方法[3]，通過(guò)檢測(cè)CD34+的表達(dá)評(píng)估骨髓移植的效果，也可以作為擴(kuò)增HSCs的標(biāo)記，該類(lèi)干細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖能力。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CD34+HSCs在體內(nèi)可以分化成呼吸道上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞等[6-8]。臍帶血中含有較多的HSCs，將CD34+臍帶血HSCs移植入小鼠體內(nèi)后，可以分化成人CD45+、CD3+和CD151+等細(xì)胞，從而成功建立HISM模型。但是，使用臍帶血HSCs建立的HISM體內(nèi)免疫環(huán)境無(wú)法與人的腫瘤組織相匹配，將患者的腫瘤組織移植入此類(lèi)HISM后，其免疫系統(tǒng)并不能與原發(fā)瘤相對(duì)應(yīng)[2-4]。如果將患者外周血的HSCs移植于小鼠體內(nèi)后建立HISM，該小鼠體內(nèi)微環(huán)境與患者腫瘤組織生長(zhǎng)環(huán)境相似，可以使腫瘤特性與患者更相似。正常情況下，人外周血中CD34+HSCs較少，不能提供足量的移植用細(xì)胞，而化療后患者骨髓再生的早期CD34+HSCs顯著增加，此時(shí)給予患者注射粒細(xì)胞刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)，則骨髓增生加快，骨髓腔內(nèi)壓力升高，外周血中的CD34+HSCs會(huì)進(jìn)一步增多[9-10]。因此，從動(dòng)員后患者外周血中可分離較多的CD34+HSCs；進(jìn)一步加入干細(xì)胞刺激因子Flt3、SCF和IL-3等擴(kuò)增培養(yǎng)，然后移植于骨髓破壞的免疫缺陷小鼠體內(nèi)，則可建立更有效的HISM，該小鼠可用于進(jìn)一步建立免疫系統(tǒng)與腫瘤組織來(lái)源于同一個(gè)患者的Hu-PDX模型[11]。(2)患者的腫瘤組織移植入HISM小鼠建立Hu-PDX模型。通常免疫缺陷小鼠接種人免疫細(xì)胞(HISM)4周后將患者腫瘤組織移植于其體內(nèi)，腫瘤能夠生長(zhǎng)，且小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的人源性免疫細(xì)胞成分及細(xì)胞因子等與腫瘤之間相互作用，在模型腫瘤組織中能夠檢測(cè)到人的免疫治療靶點(diǎn)和細(xì)胞因子等，腫瘤在病理形態(tài)及基因完整性等方面顯示出更好的腫瘤異質(zhì)性，標(biāo)志Hu-PDX模型建立成功[12-13]。

2 Hu-PDX模型建立成功的影響因素

Hu-PDX模型是否能夠建立成功與HSCs的數(shù)量和小鼠品系的選擇等因素密切相關(guān)。外周血PBMCs中分離的CD34+HSCs使用干細(xì)胞專(zhuān)用無(wú)血清培養(yǎng)基聯(lián)合細(xì)胞因子Flt3、SCF、G-CSF等的刺激能夠擴(kuò)增數(shù)十倍，足夠的細(xì)胞數(shù)量也是保證免疫重建成功的前提條件，文獻(xiàn)報(bào)道每只小鼠移植量必須不低于5×105個(gè)[5,7]；不同品系的免疫缺陷小鼠都可用作實(shí)體瘤的移植，然而由于人免疫細(xì)胞的生存需要高度依賴兼容性信號(hào)，很容易在宿主吞噬信號(hào)的作用下被吞噬，這些小鼠并不都適合建立人源化免疫系統(tǒng)(humanized immune system, HIS)[13-14]。通常被用作建立人源化小鼠模型的小鼠有：NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjill/SzJ)、NOG(NOD.CgPrkdcscidIL2rgtm1Sug/JicTac)、BRG(C.Cg-Rag1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ)。NOD(非肥胖糖尿病)背景的小鼠有NK細(xì)胞功能缺陷；SCID(嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷)是一種功能缺失突變即影響DNA依賴的蛋白激酶(DNA-PK), 一種在T細(xì)胞和B細(xì)胞發(fā)育的過(guò)程中參與V(D)J重組的DNA修復(fù)酶。因此，SCID小鼠體內(nèi)T細(xì)胞和B細(xì)胞水平降低。失活的白介素-2(IL-2)受體γ-鏈導(dǎo)致T細(xì)胞和B細(xì)胞發(fā)育障礙并阻止NK細(xì)胞產(chǎn)生。重組激活基因1(RAG1)是V(D)J重組的必要條件；因此，RAG1失活突變影響T細(xì)胞和B細(xì)胞的發(fā)育。以上幾種品系小鼠在有功能的人免疫細(xì)胞移植方面表現(xiàn)出細(xì)微差別。PBMCs移植免疫缺陷小鼠一般免疫成分可以保持2～5周。將CD34+HSCs注射入這些小鼠體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex, MHC)限制了T細(xì)胞和B細(xì)胞，以及單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的數(shù)量，通常人的免疫細(xì)胞成分在小鼠體內(nèi)可以保持8～9周。另外，有些品系小鼠經(jīng)過(guò)基因改造后可以產(chǎn)生多種人類(lèi)細(xì)胞因子，進(jìn)一步刺激造血系統(tǒng)的分化。比如，NOG-GM3小鼠表達(dá)人IL-3和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，NSG-SGM3小鼠表達(dá)人IL-3，GM-CSF和SCF(也稱為KIT ligand)，MISTRG小鼠表達(dá)人IL-3，GM-CSF和巨噬細(xì)胞CSF(也叫CSF1)。這些小鼠體內(nèi)信號(hào)監(jiān)管蛋白-α(SIRPα)和促血小板生成素(THPO)的產(chǎn)生增加了人骨髓、肥大細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和NK細(xì)胞的數(shù)量[13-15]。文獻(xiàn)報(bào)道[15-16]，使用PBMC移植NOG/NSG/BRG小鼠建立的HISM只能產(chǎn)生T細(xì)胞和NK細(xì)胞，而使用CD34+HSCs移植NOG/NSG/BRG/ NOG GM3/ NSG SGM3小鼠建立的HISM可以產(chǎn)生人的T細(xì)胞和B細(xì)胞，以及單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞，使用CD34+HSCs移植MISTRG小鼠建立的HISM可以產(chǎn)生除人T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞以外的NK細(xì)胞，MISTRG小鼠目前最合適用作建立HISM和腫瘤移植，用于制備Hu-PDX模型體現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。腫瘤類(lèi)別不同移植成功率具有較大差別，腫瘤本身的惡性程度與移植成功率具有正相關(guān)性，此外，移植部位、腫瘤新鮮度、清潔度及在運(yùn)輸過(guò)程中的保存等與移植的成功率也有一定的關(guān)系[16-17]。

3 Hu-PDX模型在臨床前中的應(yīng)用

3.1 免疫治療

人類(lèi)免疫系統(tǒng)成功移植入小鼠體內(nèi)建立HISM 模型的一個(gè)基本特性是具有抗腫瘤免疫反應(yīng)能力。研究人員通過(guò)移植人免疫系統(tǒng)和頭頸部腫瘤，成功建立了具有免疫治療靶點(diǎn)的Hu-PDX模型[18-19]。在最近一項(xiàng)研究中，Sanmamed等[ 20]將胃癌患者的淋巴細(xì)胞注射到Rag 2-/--Il2γnull小鼠后，這些細(xì)胞在小鼠體內(nèi)被激活并重新分布到小鼠體內(nèi)各部位，流式檢測(cè)顯示，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了人CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞，4周左右產(chǎn)生了GVHD，人PD-1主要由T細(xì)胞及其亞群誘導(dǎo)產(chǎn)生，人CD137主要由CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生；當(dāng)該小鼠注射nivolumab(納武單抗，一種PD-1抑制劑)和urelumab(一種抗CD137的激動(dòng)劑)后GVHD反應(yīng)加重；進(jìn)一步將同一個(gè)患者的胃癌組織移植到該方法建立的HISM體內(nèi)，上述藥物的使用會(huì)誘導(dǎo)自身T細(xì)胞的攻擊，減緩腫瘤的生長(zhǎng)[20]。另外，目前腫瘤免疫調(diào)節(jié)靶向治療也是一個(gè)熱點(diǎn)，Chang等[8]使用PBMCs建立的人源化腎細(xì)胞癌原位模型用于檢測(cè)靶向碳酸酐酶IX蛋白的有效性，結(jié)果顯示該抗體誘導(dǎo)產(chǎn)生的T細(xì)胞能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)。Hu等[ 21]聯(lián)合移植人胎胸腺組織和轉(zhuǎn)染人HLA I類(lèi)限制性黑素瘤抗原(MART-1)TCR基因的CD34+HSPCs成功建立了HISM模型，這種小鼠體內(nèi)可以產(chǎn)生MART-1-TCR+人T細(xì)胞；這些T細(xì)胞在體外可以用來(lái)觀察特異抗原對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的攻擊；當(dāng)這些T細(xì)胞移植到NSG黑色素荷瘤小鼠后，動(dòng)物的生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)[21-23]。另外，目前Ipilimumab(易普利姆瑪，靶向CTLA-4)單克隆抗體，nivolumab(靶向PD-1)和urelumab(靶向PD-1)已經(jīng)在免疫靶向治療方面獲得了較好的效果。

3.2 精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)靶向治療

沒(méi)有經(jīng)過(guò)分子篩選的腫瘤靶向治療有效率僅在10%～20%之間[17]，而人們依據(jù)藥物有效的分子特點(diǎn)和腫瘤的異質(zhì)性對(duì)患者進(jìn)行分層則取得了良好的效果。比如將小細(xì)胞肺癌患者按照EML-4-ALK+進(jìn)行分層，其靶向治療藥物ALK激酶對(duì)小細(xì)胞肺癌EML-4-ALK+的抑制反應(yīng)明顯增加[24]。然而即使給患者分層，臨床反應(yīng)也是短暫的，在疾病進(jìn)展前通常只有6～12個(gè)月[17]，因此了解腫瘤的異質(zhì)性僅僅是提高藥物療效的第一步。腫瘤細(xì)胞群對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力特別強(qiáng)，可以很快進(jìn)化為沒(méi)有免疫系統(tǒng)的微環(huán)境的一部分。當(dāng)人的腫瘤組織移植到免疫缺陷鼠后，由于鼠系的微環(huán)境缺乏免疫系統(tǒng)，因此治療結(jié)果往往與患者不一致。文獻(xiàn)報(bào)道[18-19]，雖然PDX模型較好的保持了腫瘤異質(zhì)性，但在傳代過(guò)程中也會(huì)丟失部分基因，因此，PDX模型用于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)靶向治療具有一定的局限性。

Hu-PDX模型呈現(xiàn)出與人體內(nèi)相似的動(dòng)態(tài)微環(huán)境。在該模型中人們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞釋放的趨化因子與基質(zhì)產(chǎn)生的信號(hào)之間會(huì)相互影響[11]。如，癌細(xì)胞由于基因突變會(huì)產(chǎn)生異常的表面抗原，通常這些抗原會(huì)遭受循環(huán)T細(xì)胞和NK細(xì)胞攻擊，而癌細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子可以同化附近的免疫細(xì)胞并逃脫免疫監(jiān)視；另外，癌細(xì)胞表達(dá)的配體也可抑制效應(yīng)免疫細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]。在Hu-PDX模型中發(fā)現(xiàn)，趨化因子CCL22可以誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子TGF-β和IL-10可以下調(diào)附近的免疫細(xì)胞活性，同樣，許多細(xì)胞因子，包括CCL2，HIF-1α和VEGF可以募集腫瘤細(xì)胞中的循環(huán)單核細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞(MDSC)，這些細(xì)胞又可以在腫瘤內(nèi)分化成相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)，許多TAMs快速?gòu)腗1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)換為M2型巨噬細(xì)胞，從而抑制其他細(xì)胞的免疫活性，促發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)[6,11]。此外，在Hu-PDX模型中腫瘤和/或抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)的配體可以抑制效應(yīng)免疫細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)受體，如細(xì)胞程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1, PD-1)，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T lymphocyte associate protein-4, CTLA-4)[6]。這種動(dòng)態(tài)的微環(huán)境促使Hu-PDX模型中腫瘤組織能夠更好的保持腫瘤基因序列的完整性，PD-1等信號(hào)通路的存在也為腫瘤的靶向治療提供與人體更相近的生長(zhǎng)環(huán)境。如，免疫重建的人頭頸部腫瘤Hu-PDX模型不僅可以較好的保持腫瘤分子的異質(zhì)性而且可以將部分丟失的基因重現(xiàn)。Horn等[16]報(bào)道，以T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞的雙特異性單鏈抗體(Bi-specific T cell engagers, BiTEs)，即，一種基因工程聯(lián)合蛋白，特異性靶向細(xì)胞程序性死亡-配體1(programmed cell death 1 ligand 1, PD-L1)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞和CD3+PBMC，通過(guò)CD3復(fù)合物和靶向活化的腫瘤T細(xì)胞誘導(dǎo)了細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)的產(chǎn)生，進(jìn)而殺死PD-L1的腫瘤細(xì)胞，延長(zhǎng)人源化荷瘤小鼠的生存時(shí)間，但是這種靶向藥物對(duì)于不存在PDL1+信號(hào)通路的腫瘤組織是無(wú)效的。因此，Hu-PDX模型對(duì)腫瘤異質(zhì)性的保留能力和它的人源化特性決定了它在精準(zhǔn)靶向醫(yī)學(xué)治療中的重要性[25-26]。

3.3 腫瘤發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究

腫瘤的發(fā)生是由細(xì)胞和其周?chē)奈h(huán)境相互作用造成的?；颊唧w內(nèi)的原發(fā)腫瘤微環(huán)境參與了腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)、產(chǎn)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等。在腫瘤間質(zhì)與腫瘤的相互作用過(guò)程中，腫瘤從外界獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，逐漸生長(zhǎng)出新的血管，增加了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。當(dāng)部分腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落，進(jìn)入局部血管組織，便會(huì)隨著血液循環(huán)在適應(yīng)的新部位形成繼發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移灶[27-28]。研究報(bào)道Hu-PDX模型微環(huán)境與原發(fā)腫瘤更相似，在腫瘤生長(zhǎng)的過(guò)程中能夠更好的反應(yīng)腫瘤與腫瘤間質(zhì)的相互作用，為腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等的研究提供了更可靠的研究工具[29]。如，Hu-PDX模型小鼠體內(nèi)含有人源化調(diào)節(jié)淋巴管及人細(xì)胞因子，它們具有免疫監(jiān)控、炎癥和致瘤作用，可以與腫瘤之間相互影響[30-31]。

4 Hu-PDX模型的不足

為了避免由人HLA不匹配而引起的免疫反應(yīng)，Hu-PDX模型的建立，至少要求造血干細(xì)胞來(lái)源與腫瘤來(lái)源患者的HLA相匹配，而最理想的是造血干細(xì)胞來(lái)源與建立PDX模型的腫瘤來(lái)源是共同患者[3,6]。但是，從癌癥患者分離造血干細(xì)胞并不是一件容易的事情，一方面腫瘤患者身體較虛弱，從骨髓取造血干細(xì)胞損傷大，有一定的困難；另一方面，患者化療后，經(jīng)GM-CSF刺激動(dòng)員后的外周血中，造血干細(xì)胞的數(shù)量并不是很多，患者的年齡、自身伴隨疾病等會(huì)影響外周血?jiǎng)訂T的效果，若患者年齡大于65歲或是伴隨有糖代謝障礙疾病等則動(dòng)員外周血失敗的可能性更大，即動(dòng)員后患者外周血中CD34+HSCs的含量達(dá)不到2×106/kg，而身體狀況較好的患者，動(dòng)員后外周血干細(xì)胞含量可以達(dá)到5×106/kg，嚴(yán)重限制了人源化小鼠建立的數(shù)量[30-31]。隨著造血干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的成熟，在細(xì)胞因子的刺激下聯(lián)合專(zhuān)用培養(yǎng)基，造血干細(xì)胞可以在體外擴(kuò)增數(shù)倍，但是小鼠免疫系統(tǒng)的重建需要至少一個(gè)月，而新鮮的腫瘤組織在小鼠體內(nèi)移植成功也通常需要2～4個(gè)月，整個(gè)過(guò)程時(shí)間較長(zhǎng)，花費(fèi)也較大。

5 展望

Hu-PDX模型不僅可以展現(xiàn)人體腫瘤臨床進(jìn)程，而且給腫瘤的生長(zhǎng)提供了與人體相似的微環(huán)境，較好的模擬了腫瘤在人體內(nèi)生長(zhǎng)、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過(guò)程，同時(shí)也使研究者可以了解腫瘤對(duì)免疫藥物的反應(yīng)，從而促進(jìn)了腫瘤病理及分子等異質(zhì)性的保持，為腫瘤的精準(zhǔn)靶向治療提供了更有效的工具[1,3]。重建的模型與患者免疫系統(tǒng)的匹配是Hu-PDX模型的關(guān)鍵問(wèn)題。采用CD34+HSCs或成熟循環(huán)PBMCs的標(biāo)準(zhǔn)方法可能會(huì)對(duì)人體或小鼠組織造成一些免疫損傷。為了持續(xù)研究腫瘤免疫的相互作用，重建的免疫系統(tǒng)必須同時(shí)保持對(duì)人類(lèi)供體的耐受性和其新宿主獲得的耐受性。雖然，目前已經(jīng)有研究報(bào)道，使用MISTRG小鼠建立的人源化小鼠能夠產(chǎn)生具有免疫功能的免疫細(xì)胞，但是Hu-PDX模型的建立還面臨著較長(zhǎng)的道路，需要我們不斷探索[22-23]。