雙液相系統(tǒng)酶化學(xué)技術(shù)制取茶色素

摘要：在本次實(shí)驗(yàn)研究中，我們利用了雙液相媒化學(xué)技術(shù)來(lái)制取茶色素，并且以單液相系統(tǒng)進(jìn)行茶多酚酶促氧化，進(jìn)而將單液相制取茶色素作為對(duì)照組。在加入氧載體之后構(gòu)成了雙液相酶化學(xué)氧化系統(tǒng)，其中對(duì)溶解氧濃度，茶黃素類(lèi)（TFs）含量，高效液相圖譜分析，茶多酚氧化酶（PPO）和茶紅素類(lèi)進(jìn)行分析。最終，我們?cè)诤铣芍破分蠺Fs的高效液相色譜的研究中發(fā)現(xiàn)，TOP1和TFs的響應(yīng)值以及峰面積均要高于TOP2制品中的TFs，尤其是TFG與TFDG這兩者的響應(yīng)值較高，TOP-1的制品中兒茶素類(lèi)殘留量相比對(duì)照組來(lái)說(shuō)較少，尤其是簡(jiǎn)單兒茶素的殘留量更少。

關(guān)鍵詞：雙液相;酶化學(xué);制取;茶色素

一、 國(guó)內(nèi)外茶色素制取的現(xiàn)狀

茶色素是茶葉中一種獨(dú)特的多酚類(lèi)氧化縮聚物，是利用茶發(fā)酵而形成的茶色素，具有抗氧化和清除體內(nèi)自由基的作用，目前已經(jīng)被廣泛用于心腦血管疾病治療，動(dòng)脈粥樣硬化治療。降低血壓、血脂等藥物的研究中，可以從紅茶中提取有茶色素，但是這種方法獲取的茶色素效率較低，提取質(zhì)量較差，而且分離純化難度較高。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外采用了體外酶促模擬發(fā)酵的方法或者通過(guò)有機(jī)合成來(lái)進(jìn)行茶色素的形成與制取，且已經(jīng)取得一定的成就。由于酶具有高效性和專(zhuān)一性催化，研究學(xué)者高度重視酶的反應(yīng)特征，通過(guò)利用酶反應(yīng)催化以及微生物來(lái)進(jìn)行化學(xué)合成，并將其作為新的酶工程研究——酶化學(xué)技術(shù)。目前在有機(jī)合成的研究中，酶的使用范圍不斷擴(kuò)大，尤其是在一些手性化合物的合成中，酶起到了關(guān)鍵的作用。比如茶黃素類(lèi)的合成，利用PPO能夠高效制取，兒茶素結(jié)構(gòu)中的C2—H與C3—H鍵的存在能夠保留在茶黃素的結(jié)構(gòu)中。酶化學(xué)技術(shù)通常是在水介質(zhì)中進(jìn)行，在該介質(zhì)中制取茶色素溶氧量較低，而且氧氣作為茶色素形成的重要底物之一，由于溶氧量受到限制而抑制了茶色素的形成。為了增加溶解氧濃度，在單液相中加入與水不相溶的有機(jī)液相，這樣構(gòu)成了雙液相系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在茶多酚酶促氧化條件下，相比單液相來(lái)說(shuō)，這種雙液相系統(tǒng)的溶氧量提高了兩倍多，而且酶的穩(wěn)定性也相對(duì)增強(qiáng)，活性提高了百分之兩百。自20世紀(jì)50年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)學(xué)者針對(duì)茶發(fā)酵實(shí)質(zhì)以及反應(yīng)機(jī)理展開(kāi)研究，茶葉勻漿懸浮液的發(fā)酵，體外酶性或者一些非酶性的氧化兒茶素，進(jìn)而制取茶色素。但是在雙液相系統(tǒng)中，通過(guò)酶化學(xué)技術(shù)制取茶色素的相關(guān)研究比較少。在雙液相體系中，我們應(yīng)用酶來(lái)催化氧化茶多酚，進(jìn)而制取茶色素，尤其是制取一些含有較低濃度咖啡堿，而高濃度茶黃素的生物活性的茶橙素制品，目前已經(jīng)取得了不錯(cuò)的成績(jī)。

二、 研究方法

在本次研究過(guò)程中，我們所需要的有機(jī)溶劑均為分析純，包括乙酸乙酯，正丁醇，油酸，正己烷等，利用吸附樹(shù)脂NKA=9的柱子進(jìn)行分離制備茶色素。所使用的儀器有：溶氧分析儀，生物反應(yīng)器，LZB型玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)。

在具體的方法中，我們利用了雙液相酶化學(xué)技術(shù)來(lái)制取茶色素。首先稱(chēng)取5克的茶多酚，加入500mL檸檬酸——磷酸氫二鈉的緩沖液中，最終調(diào)節(jié)pH為5.6，溶解之后加入500mL的OV-4以及40mL的酶制劑，通入每分鐘20mL的氧氣，在27℃的溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)，經(jīng)過(guò)1.5小時(shí)之后反應(yīng)完成，分離油相，利用旋轉(zhuǎn)蒸餾濃縮干燥獲得茶橙色素，（TOP-1）水相經(jīng)過(guò)吸附樹(shù)脂柱層析春花看，用80%的乙醇洗脫，經(jīng)過(guò)減壓蒸餾濃縮后得到茶紅色素。在對(duì)照組實(shí)驗(yàn)中，我們利用了單液相酶化學(xué)技術(shù)來(lái)制取茶色素，這里的方法如上述所示，但是我們沒(méi)有添加氧載體OV-4，最終制得的樣品為茶橙素和茶紅色素。提取分離茶多酚氧化酶，通過(guò)雙液相系統(tǒng)中多酚氧化酶的活性進(jìn)行測(cè)定中，由于在雙液相系統(tǒng)中，酶主要分布于水相中，在水相中進(jìn)行氧化催化實(shí)驗(yàn)，由于反應(yīng)中存在大量的茶多酚底物，在測(cè)定茶多酚氧化酶活性時(shí)，需要進(jìn)行去除。具體方法是將聚酰胺柱子中加入 5mL 的反應(yīng)液，流出濾液中不會(huì)顯示酚性反應(yīng)，取3mL的氯液用于茶多酚氧化酶活性分光光度計(jì)的測(cè)定，利用高效液相色譜分析茶色素和兒茶素。

三、 研究結(jié)果

1. 篩選雙液相的油相。再利用單液相系統(tǒng)制取茶色素過(guò)程中，由于水中溶解氧的含量不足，而導(dǎo)致茶色素形成受到限制，在1984年Robertson A的實(shí)驗(yàn)表明，茶葉體外酶促氧化過(guò)程中體系中，有由于溶氧量較低，在20℃時(shí)，每個(gè)大氣壓溶氧量?jī)H能達(dá)到3%，而其實(shí)茶葉體外外酶促氧化過(guò)程中20%的溶氧量是反應(yīng)的最適濃度。在雙液相系統(tǒng)中，由于加入了油相而提高了氧氣的溶解量，有效解決了上述氧氣不足的問(wèn)題。因而油相的篩選是比較重要的。茶色素可以分為藥用色素和天然食用色素，再進(jìn)行油相篩選過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)考慮到經(jīng)濟(jì)因素，篩選出一些溶氧量較高，茶多酚容量大，茶多酚氧化酶和分布較好，穩(wěn)定性強(qiáng)，活性較高，且對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染，無(wú)毒，成本低，易回收的有機(jī)溶劑。經(jīng)過(guò)對(duì)多種有機(jī)溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，我們最終認(rèn)為OV-4作為氧載體是比較好的，分別對(duì)茶多酚氧化酶和溶氧量濃度，茶色素的形成量進(jìn)行分析。

2. 水相中OV-4的體積比以及溶氧量的變化。在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)在有機(jī)溶劑中，氧氣的溶解度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于水中，因而采用水相-油相的雙液相體系能夠大大增強(qiáng)氧氣的溶解量，提高氧的傳遞效率。我們將對(duì)氧氣較高溶解度而不溶于水的有機(jī)溶劑中氧載體。而OV-4就是一種比較好的氧載體。研究表明，有機(jī)溶劑OV-4的鋪展系數(shù)為正，其體積傳遞系數(shù)會(huì)隨著油相體積百分?jǐn)?shù)增大而增大，而且與此同時(shí)，氧溶量也會(huì)增加，當(dāng)油相體積比達(dá)到25%以上時(shí)，溶氧量增加會(huì)變慢。

3. 溶氧量對(duì)于茶色素形成的影響。在進(jìn)行制取茶色素的過(guò)程中，氧氣是茶多酚氧化反應(yīng)中重要的底物，由于茶多酚氧化酶對(duì)于氧存在較大的米氏常數(shù)，低氧濃度不利于兒茶素的酶促氧化過(guò)程，尤其是EC和ECG不能與EGC與EGCG這些進(jìn)行配對(duì)縮合姘環(huán)反應(yīng)，而導(dǎo)致茶黃素合成受到抑制，進(jìn)而茶紅素的合成也會(huì)受到一定的影響。然而，在雙液相系統(tǒng)制取茶色素時(shí)，由于增加了溶解氧的供給，進(jìn)而提高了酶促氧化的反應(yīng)過(guò)程，提高了茶黃色和茶紅素的合成含量，具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下表所示。

表1水-OV-4雙液相體積與溶氧量

油相/水相（v/vx100）溶氧量（mg/L）05.21012.11514.22016.53018.54019.55020表2供氧量與TFs形成含量

反應(yīng)時(shí)間水-OV-4雙液相單液相溶氧量TFs含量溶氧量TFs含量0————0.513.4801.271122.81603.8781. 524.61908.480225.221411.880324.82389.878從表中我們發(fā)現(xiàn)雙液相系統(tǒng)制取茶色素過(guò)程中，隨著不斷通氧進(jìn)行酶促氧化反應(yīng)，溶氧濃度迅速增加，進(jìn)而茶黃素的含量也不斷累積，在反應(yīng)后三小時(shí)，茶黃素的和茶紅素合成速度會(huì)達(dá)到高峰，也證明在雙液相系統(tǒng)中，當(dāng)氧氣的流速為每分鐘20mL是最適反應(yīng)條件，在這個(gè)條件下茶黃素的含量是利用單向系統(tǒng)合成茶黃素的三倍，在單液相體系中，雖然溶氧量也有所提升，但相比雙液相溶氧量來(lái)說(shuō)，僅為20%以下，從而從一定程度上抑制了茶色素的形成。

4. 雙液相系統(tǒng)中茶多酚氧化酶的活性。在雙液相系統(tǒng)中由于增加溶氧量，而使得茶多酚氧化酶的活性得以提高，經(jīng)過(guò)研究，我們發(fā)現(xiàn)在雙液相系統(tǒng)中茶多酚氧化酶，由于催化茶多酚形成茶色素，經(jīng)過(guò)兩個(gè)小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間后，茶多酚氧化酶的活性達(dá)到最大值之后，活性會(huì)逐漸降低，在反應(yīng)三小時(shí)之后，茶多酚氧化酶的活性為135%，然而在單液相系統(tǒng)中，茶多酚氧化酶的活力是逐漸降低的，在反應(yīng)三小時(shí)之后酶的活性僅為雙液相系統(tǒng)的一半。

5. 底物的濃度對(duì)茶色素形成的影響。在茶色素的反應(yīng)過(guò)程中，隨著底物濃度增大，茶色素的合成率也相應(yīng)增加，但當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到某一高濃度時(shí)，對(duì)茶多酚氧化酶的活性產(chǎn)生抑制，因此在制取茶色素的過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)選擇適當(dāng)?shù)牡孜餄舛?，在雙液相反應(yīng)系統(tǒng)中，70%的底物茶多酚會(huì)進(jìn)入油相，其余30%進(jìn)入水相，茶多酚氧化酶會(huì)進(jìn)入水相，因而茶多酚氧化酶催化氧化茶多酚的反應(yīng)發(fā)生在水相，其產(chǎn)物主要分布在水相，然而茶色素卻進(jìn)入了油相，活躍平衡分布，比如水相中茶多酚經(jīng)過(guò)氧化之后，會(huì)從油相中得到補(bǔ)充。國(guó)外研究學(xué)者在體外模擬發(fā)酵和酶催化查茶兒茶色素形成茶色素時(shí)，采用的是1%的茶多酚濃度，而在雙液相系統(tǒng)的研究中，我們利用了2%的茶多酚濃度。在過(guò)去的研究中表明，在雙液相系統(tǒng)中酶的平衡理論和動(dòng)力學(xué)，可以將該理論用于實(shí)踐指導(dǎo)。

6. 茶色素制品的化學(xué)成分。天然制成的茶色素中主要的成分包括TFs和TRs，茶色素制品根據(jù)工藝流程獲得的茶橙色素與紅色素中，茶橙色素的主要成分為T(mén)Fs和TRSI，而茶紅色素的主要成分為T(mén)RSII和TRSIa。我們?cè)诒敬螌?shí)驗(yàn)中，主要分析茶橙色素的化學(xué)組成，通過(guò)高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，在雙液相系統(tǒng)中茶橙色素與單液相制品中的茶色素的化學(xué)成分，吸收峰能夠明顯辨別，通過(guò)保留時(shí)間可以發(fā)現(xiàn)其與茶紅色素的組成成分是比較相似的。尤其對(duì)于TFs的成分來(lái)說(shuō)，它們的響應(yīng)值是重疊的，而TRSI的組成成分相比茶紅色素來(lái)說(shuō)大大降低。

茶色素中主要包括了茶黃色素和茶紅色素，而茶黃素類(lèi)包括了茶黃素與茶黃酸，茶紅素類(lèi)包括多種成分，它們的色譜行為與光譜特征均有所差異。茶黃素類(lèi)是一種苯苯駢草酚酮的衍生物。苯駢草酚酮的核上具有多個(gè)酚羥基和羰基。其中通過(guò)C2—C6以及C2—C4化學(xué)鍵可以與兩個(gè)苯駢二氧吡喃環(huán)相連接，雖然是單鍵相連，但由于受到空間位阻的影響，而使得自由旋轉(zhuǎn)受阻，具有一定構(gòu)象，具有特異的生理活性，比如能夠抗凝、降低血脂等。茶黃素形成需要兒茶素與沒(méi)有食子集兒茶素配對(duì)，在B環(huán)上的鄰位二羥基與B環(huán)上連位三羥基酸配對(duì)，在茶多酚氧化酶的催化下進(jìn)行氧化駢環(huán)形成。茶黃酸也屬于茶駢草酚酮的衍生物之一，它的結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)羥基、羰基和羧基。茶黃酸類(lèi)極易溶于水，齊極性較大，尤其可以溶于乙酸乙酯。在過(guò)去的研究中，認(rèn)為苯黃酸類(lèi)在紅茶中含量較少，制茶發(fā)酵中很活躍，很容易轉(zhuǎn)化為茶紅素類(lèi)。茶磺酸是由表兒茶沒(méi)食子酸質(zhì)以及沒(méi)食子酸氧化瓶還而形成的。茶紅素是一種異質(zhì)酚性色素物質(zhì)，它的分子量不等，大概范圍為700到4萬(wàn)，差異比較明顯，極性相比茶黃素類(lèi)來(lái)說(shuō)較強(qiáng)，而且化學(xué)組分結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，至今還沒(méi)有分離出茶紅素類(lèi)的單體，只是將其層析或者溶劑萃取分成若干的成分進(jìn)行研究。

四、 小結(jié)

在本次研究中我們比較了雙液相系統(tǒng)以及單液相系統(tǒng)酶化學(xué)技術(shù)在提取茶色素的區(qū)別。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙液相酶化學(xué)氧化系統(tǒng)中，由于茶多酚氧化酶的活性，溶解氧濃度都相應(yīng)增強(qiáng)，因而使得最終制取的茶色素含量較高。

參考文獻(xiàn)：

[1]蕭偉祥，李立祥，蕭慧.茶色素制取的生物化學(xué)[J].蠶桑茶葉通訊，2003（1）：5-7.

[2]羅學(xué)平，李麗霞，成洲，等.茶多酚氧化產(chǎn)物制備方法研究進(jìn)展[J].南方農(nóng)業(yè)，2017，11（22）：96-99.

[3]杜歡歡.茶葉中茶多酚、茶色素檢測(cè)技術(shù)研究及茶多酚快速檢測(cè)技術(shù)構(gòu)建[D].漢中：陜西理工大學(xué)，2017.

[4]李立祥.茶色素形成機(jī)理及制取新工藝研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

作者簡(jiǎn)介：

李淑蓮，寧夏回族自治區(qū)銀川市，寧夏工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院能源化工學(xué)院。