缺血性組織損傷中內(nèi)皮祖細胞的作用

蔣月麗 梁 冬 余靖一 龐明武 何超明 王源江 趙振強

(海南省第三人民醫(yī)院老年醫(yī)學中醫(yī)科，海南 三亞 572000)

組織缺血損傷在臨床上十分常見，如心肌梗死后心肌損傷，缺血性腦卒中所致腦組織損傷及肢體缺血損傷等〔1～3〕。造成缺血性損傷的關鍵因素在于組織供血不足〔4〕。大量研究表明，內(nèi)皮祖細胞(EPCs)在缺血性組織損傷中發(fā)揮著重要的保護作用，如促進缺血組織血管新生，修復受損的血管內(nèi)皮等。本文以EPCs在缺血性組織損傷中的修復潛能為主題，對現(xiàn)有的研究進行綜述，并探討基于EPCs臨床治療的潛在問題和應用前景。

1 EPCs及其生物學特性

1.1EPCs來源 EPCs是來源于機體骨髓的一種特定的造血祖細胞(HPCs)〔5〕。該細胞是未成熟的內(nèi)皮細胞(ECs)，可通過骨髓動員進入外周循環(huán)血液中。1997年，Asahara等〔6〕首次從人外周血中分離出EPCs，并進行體外培養(yǎng)。目前已經(jīng)能夠從多種組織樣本獲取EPCs，包括循環(huán)單核細胞群、臍帶血及骨髓〔7～11〕。

1.2EPCs的表型特征 迄今為止，對于EPCs的表型特點尚無明確的定論。Asahara等〔6〕發(fā)現(xiàn)，EPCs能夠表達造血干細胞表面抗原CD34。EPCs還能夠表達CD133表型分子〔8，12〕。此外，這類細胞表達一些內(nèi)皮特異性的細胞表型分子，包括：血小板內(nèi)皮細胞黏附分子(CD31/PECAM1)、血管內(nèi)皮生長因子受體(KDR/Flk-1)、內(nèi)皮細胞特異性酪氨酸激酶受體(Tie)2、血管性血友病因子(vWF)及血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-Cadherin)〔13〕。

1.3EPCs的生物學功能 體外培養(yǎng)的EPCs呈貼壁式生長，細胞形態(tài)為梭狀，能攝取乙?；兔芏戎鞍?ac-LDL)〔14〕。ECs分化潛能是EPCs的重要功能特性〔6〕。另外，EPCs還具有其他功能特征，包括：遷移、黏附和小管形成〔15～17〕。EPCs對于維持血管穩(wěn)態(tài)具有重要的生理意義，并受到了廣泛關注〔5，18〕。一方面，EPCs具有內(nèi)皮分化的潛能，直接參與內(nèi)皮再生〔8〕；另一方面，由EPCs分泌的促血管生成因子〔如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管緊張素(Ang)-1等〕和相關細胞因子〔如白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α等〕，在血管新生過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用〔19，20〕。

2 EPCs在組織缺血損傷修復中的作用

大量動物實驗研究表明，EPCs能夠向缺血組織部位遷移，并分化形成ECs，參與血管新生〔13，21〕。同時，EPCs通過分泌細胞因子和生長因子等旁分泌物質(zhì)，在缺血組織部位構(gòu)建保護性微環(huán)境，促進缺血組織損傷修復〔20，22〕。目前，有關EPCs在缺血性組織損傷中的保護作用研究，主要涉及心肌梗死、缺血性腦卒中、肢體缺血損傷〔13，23，24〕。

2.1缺血性心臟病(MI) MI是危害人類健康的心血管病(CVD)中常見類型之一，主要表現(xiàn)為心臟局部組織血供減少或停止〔25〕。據(jù)報道，在美國，每年約有79萬人發(fā)生心肌梗死〔26〕。最近，《中國心血管病報告2016》發(fā)文指出，我國CVD危險因素流行趨勢明顯，CVD發(fā)病人數(shù)增多(約2.9億)，其中大陸MI患病人數(shù)約為1 140萬，且急性心肌梗死(AMI)死亡率總體呈上升態(tài)勢〔27〕。目前，人們已經(jīng)在心肌梗死動物模型和臨床患者中對EPCs的作用進行了相關研究。

在心肌梗死動物模型中研究發(fā)現(xiàn)，采用體外擴增的EPCs移植治療后，動物心臟供血明顯改善，心功能明顯提高，同時，心肌瘢痕形成明顯減少〔23〕。Kawamoto等〔28〕研究發(fā)現(xiàn)，對心肌梗死大鼠進行心肌內(nèi)自體EPCs移植治療后，缺血心肌部位微血管密度明顯增加，同時，動物左心室射血分數(shù)增加。

研究表明，EPCs數(shù)量及細胞功能與心血管危險因素呈負相關〔18，29〕。臨床研究表明，循環(huán)EPCs水平對于心血管事件的發(fā)生及預后評估具有一定的診斷價值〔30〕。目前，一些臨床試驗正致力于研究EPCs在心肌梗死中的作用。一項前瞻性隊列研究試圖通過觀察ST段抬高心肌梗死(STEMI)患者，論證外周血循環(huán)EPCs與心肌梗死后再灌注損傷和心臟重構(gòu)的關系，目前該項目已處于完成狀態(tài)〔31〕。另有臨床試驗曾試圖研究局部EPCs移植治療心肌梗死，然而，這些項目最終因某些原因而終止試驗〔32，33〕。EPCs保護心肌梗死的分子機制尚未闡明。多數(shù)研究認為與細胞功能性分子有關，如一氧化氮(NO)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)等。美國國家心肺血液研究所(NHLBI)對參與心臟康復計劃的CAD患者血中EPCs數(shù)量和NO水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，執(zhí)行心臟康復計劃的患者循環(huán)EPCs數(shù)目增多，同時，部分患者血管內(nèi)NO水平升高，提示NO生物活性可能與EPCs功能相關；據(jù)此，該研究所在CAD(包括心肌梗死)患者中進行了一項臨床觀察性研究，試圖從基因水平上探索影響EPCs動員、內(nèi)皮分化和血管修復潛能的內(nèi)在因素，目前，該臨床試驗項目已處于完成狀態(tài)〔34〕。由加拿大渥太華醫(yī)院研究所發(fā)起的名為ENACT-AMI(the Enhanced Angiogenic Cell Therapy-Acute Myocardial Infarction Trial)的隨機對照試驗(RCT)研究，首次對基因與細胞治療相結(jié)合治療AMI進行了臨床探索研究，該二期臨床試驗企圖通過eNOS過表達的方式，提高自體EPCs功能，促進心肌梗死后血管新生，目前，這一項目正在受試者招募階段〔35〕。雖然，大量的臨床前動物模型研究已證實EPCs在心肌梗死損傷中具有保護作用，但是尚缺乏直接的臨床證據(jù)，仍需要進一步開展相關臨床試驗以闡明EPCs在心肌梗死患者中的保護作用及其機制。

2.2缺血性腦卒中 腦卒中是致死致殘常見的原因之一〔36〕。其中，缺血性腦卒中占腦卒中總數(shù)的70%以上〔37〕。溶栓是目前治療缺血性腦卒中唯一有效的方法，然而由于治療時間窗窄，尚不能滿足大多數(shù)患者的治療需求〔38〕。近年來，干細胞移植研究備受矚目。EPCs作為一種新型干細胞，不僅能參與血管新生，而且參與維持血管穩(wěn)態(tài)，有望成為治療缺血性腦卒中的新方法。在實驗動物模型上，人們進行了大量的基于EPCs的缺血性腦卒中治療研究。給予缺血性腦卒中小鼠EPCs輸注治療后，動物腦梗損傷明顯減輕：腦組織梗死體積顯著減小，伴隨著明顯的行為學功能改善〔13〕。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，移植的EPCs能夠歸巢于缺血損傷的腦組織部位，并參與形成新生血管，其機制可能與基質(zhì)細胞衍生因子(SDF)-1/趨化因子受體(CXCR)4信號通路有關〔13〕。EPCs能分泌多種促血管形成生長因子，如血小板衍生生長因子(PDGF)、VEGF和肝細胞生長因子(HGF)等〔20〕。將EPCs條件培養(yǎng)基通過尾靜脈注入缺血性腦卒中小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，梗死部位血管新生明顯增多，同時伴隨著神經(jīng)功能明顯改善〔22〕。目前，尚缺乏EPCs在缺血性腦卒中患者中的治療研究及相關臨床試驗。由德國Charite 大學發(fā)起的急性缺血性腦卒中患者內(nèi)皮功能及內(nèi)皮祖細胞水平變化前瞻性隊列研究試圖研究缺血性腦卒中患者急性期循環(huán)EPCs水平是否會增加〔39〕。另一項由中國南方醫(yī)科大學發(fā)起的AMETIS一期臨床試驗試圖在缺血性腦卒中患者中進行自體EPCs移植治療研究，以評估EPCs治療缺血性腦卒中的可行性、有效性及安全性〔40〕。然而，目前這兩項臨床試驗尚處于停滯狀態(tài)。仍需要對EPCs治療缺血性腦卒中患者的保護作用進行更多的研究分析，尤其是相關臨床試驗的開展。

2.3缺血性肢體損傷外周動脈疾病(PAD) PAD是一種心腦外圍區(qū)域的血管疾病〔41，42〕。引起PAD的發(fā)病因素有很多，如吸煙、糖尿病、肥胖和高血壓等〔43～45〕。據(jù)報道，PAD在40歲以上人群中的發(fā)病率高達3%，60歲以上人群的發(fā)病率會增加一倍〔46〕。其中，缺血性肢體損傷(LI)是PAD中最嚴重的類型。其發(fā)病機制為，患側(cè)肢體動脈血流受阻，尤其是下肢〔47〕。在一些地區(qū)，每年每一百萬人中就有500～1 000人遭受肢體缺血疾病的困擾〔48〕。肢體缺血病變常引起足部或腳趾疼痛，并進一步發(fā)展為肢體或足部潰瘍和壞疽，甚至導致截肢或死亡，嚴重影響患者的生活質(zhì)量〔47〕。超半數(shù)LI患者在確診后5年內(nèi)出現(xiàn)死亡〔3〕。目前，外科手術(shù)干預是處理肢體缺血病變的主要方式，如血管搭橋再通、摘除堵塞的動脈。然而，由于多種現(xiàn)實因素，超30%的患者不能從中獲益，最終選擇截肢〔47〕。再生醫(yī)學的發(fā)展為缺血性肢體病變帶來了新希望：通過誘導患肢血管新生，恢復缺血組織血液供應。在眾多再生治療研究中，EPCs的作用受到了廣泛關注。

采用裸鼠和大鼠進行臨床前實驗研究，結(jié)果表明，從動物外周血單核細胞群分離培養(yǎng)的EPCs，能夠促進動物下肢缺血后組織血管新生〔10，23，49，50〕。另有研究報道，采用人源外周血和臍帶血EPCs治療后肢缺血后，動物缺血組織部位微血管密度顯著提高〔10，50〕。目前，尚缺乏EPCs治療缺血性肢體損傷的臨床研究。Arici等〔46〕對8例重度肢體缺血患者進行EPCs細胞治療研究發(fā)現(xiàn)，自體移植外周血來源的EPCs后，有6例達到傷口完全愈合，靜息痛得到抑制，同時步行功能恢復；超聲造影結(jié)果顯示所有受試者患側(cè)肢體血流均增加。雖然早期的臨床試驗表明，EPCs細胞治療具有一定的安全性，并能促進LI患者傷口愈合。然而，仍需要進行大規(guī)模的人體試驗，以確證EPCs細胞治療是否能延長LI患者免截肢生存期。

3 問題和挑戰(zhàn)

目前對EPCs在缺血性組織損傷中的保護作用主要源于動物模型的驗證結(jié)果，還未能實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。

3.1EPCs促腫瘤形成 EPCs與腫瘤的形成可能存在一定聯(lián)系〔51～53〕。Vajkoczy等〔51〕的研究表明，EPCs可歸巢于腫瘤組織中，促進腫瘤血管新生。采用小鼠人神經(jīng)膠質(zhì)瘤移植瘤模型進行研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)注射EPCs能夠促進小鼠移植瘤生長，并增加腫瘤組織血管密度〔52〕。乳腺癌患者腫瘤組織中存在EPCs，且EPCs水平與患者血液中促血管生成因子VEGF呈正相關〔53〕。EPCs的促腫瘤效應將影響基于EPCs的治療應用，尤其是伴有癌癥或有潛在風險的患者。因此，為了排除潛在的致癌風險，需要對EPCs促腫瘤作用做深入研究，這樣才能確保基于EPCs治療缺血性組織損傷的安全性。

3.2EPCs生產(chǎn)標準化實現(xiàn) EPCs細胞治療在臨床缺血性組織損傷中的常規(guī)應用，需要使用大量的細胞。同干細胞一樣，EPCs作為一種先進療法中的醫(yī)藥產(chǎn)品，其分離、培養(yǎng)擴增及處理過程需要嚴格執(zhí)行藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)〔54，55〕。GMP的實施將為大規(guī)模生產(chǎn)滿足臨床質(zhì)量要求的EPCs帶來新挑戰(zhàn)，包括EPCs細胞的分離獲取、培養(yǎng)基和血清的使用、細胞培養(yǎng)的密度及必要的封閉式生物反應器系統(tǒng)。從人體骨髓中采集EPCs通常需要進行介入操作，而外周血和臍帶血將為EPCs的采集提供可行的替代來源。此外，為了避免引入異源性物質(zhì)，可使用血小板裂解液或者人血漿和血清替代胎牛血清對EPCs進行體外培養(yǎng)。封閉式生物反應器系統(tǒng)相關技術(shù)的應用，如微載體技術(shù)〔56〕和固定床細胞培養(yǎng)系統(tǒng)〔57〕，將為從EPCs含量稀少的樣本中獲取有效的細胞數(shù)提供保障。

值得注意的是，EPCs生產(chǎn)過程需要進行嚴格的質(zhì)量控制，包括：維持細胞表型及功能特性、避免細胞轉(zhuǎn)化及監(jiān)測微生物安全性，如此才能保證人體安全性，同時獲得穩(wěn)定的臨床治療效果。

綜上，雖然目前缺乏EPCs在缺血性組織損傷修復中的臨床研究，但是EPCs的這種保護作用在動物模型中得到了廣泛驗證，并且在人體試驗中也進行了相關報道?；贓PCs的治療方案有望成為治療或預防缺血性組織損傷的新策略。一方面，針對內(nèi)源性EPCs，可刺激骨髓動員，向外周血釋放EPCs，促進內(nèi)源性EPCs歸巢至損傷組織；另一方面，可采用自體或異體移植技術(shù)進行EPCs移植。這將為臨床上難治性組織缺血損傷提供有效的治療方法。EPCs在多種組織器官缺血損傷中具有保護作用。在人體進行的EPCs細胞治療研究結(jié)果提示，采用動物模型所獲得的臨床前實驗結(jié)論在一定程度上可實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。然而，在實現(xiàn)基于EPCs對缺血性組織損傷進行臨床治療之前，仍需要注意和解決實際應用過程中存在的一些問題，如：EPCs潛在的促腫瘤生成效應；嚴格實施GMP進行EPCs大規(guī)模生產(chǎn)。