可降解生物鎂合金在動(dòng)物體內(nèi)的溶血及過敏試驗(yàn)

崔志瓊 楊 濱 甘佼弘 林 欣 徐 晟 劉 璽 張海娜 郭 振 王曄玲

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院心血管疾病診療中心，吉林 長春 130021)

冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)病率逐年提高，成為威脅人類生命安全的一大主要疾病，而治療心血管疾病最常見有效的治療措施為血管支架的植入，該方法可以將病灶部位血管撐開，促使其恢復(fù)正常，從而能緩解患者癥狀，避免病情的進(jìn)一步發(fā)展〔1,2〕?，F(xiàn)有的不可降解支架如金屬支架、覆膜支架在經(jīng)過多年的臨床應(yīng)用，因其存在易致血栓形成，再狹窄率高，長期抗血小板治療及永久保留體內(nèi)等不足，使得人們將目光轉(zhuǎn)向生物可降解支架，其能夠克服部分永久性或者藥物洗脫性支架的不足，為血管再次介入手術(shù)提供了手術(shù)平臺(tái)〔3～7〕?？山到饨饘僦Ъ茏鳛樾乱淮苤Ъ?，可在早期為損傷血管提供足夠的力學(xué)支撐，在不引起局部和系統(tǒng)毒性的前提下，其完成血管修復(fù)任務(wù)后以合適的速率可被機(jī)體降解吸收〔8〕。目前主要有鎂合金、鐵合金和鋅合金3類可降解金屬支架材料〔9〕。近年來鎂合金支架發(fā)展較為迅速〔10～15〕，鎂合金具有密度低、強(qiáng)度高、生物相容性優(yōu)良、抗血小板聚集性，以及可在體內(nèi)降解的優(yōu)勢，其降解產(chǎn)物對(duì)生物體無毒性，且會(huì)通過人體正常的新陳代謝途徑排出〔16～18〕。因此，可降解醫(yī)用鎂合金也被譽(yù)為“革命性的生物金屬材料”而受到全世界的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)對(duì)吉林大學(xué)工程仿生教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的可降解生物鎂合金進(jìn)行研究，觀察其在動(dòng)物體內(nèi)溶血及過敏試驗(yàn)的表現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1材料、動(dòng)物及主要試劑與儀器 可降解生物鎂合金(Mg-Sn-Zn)，來自吉林大學(xué)工程仿生教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：①EWG/B豚鼠，雌雄各半，體重250～340 g,用于皮膚致敏試驗(yàn);②日本大耳白家兔(CBWR/B)，體重2.3 kg，用于體外溶血性試驗(yàn)。試劑與儀器：2,4-二硝基氯苯，LDZ5-2型普通離心機(jī)，DR-HW-1電熱恒溫水溫箱，高壓滅菌機(jī)(韓國)。

1.2可降解生物鎂合金浸提液的制備 取可降解生物鎂合金材料數(shù)枚(20 mm×8 mm×2 mm)放入滅菌離心管中加入蒸餾水，超聲清潔機(jī)清洗10 min后取出晾干，121℃高壓滅菌20 min后烘干置于無菌的錐形瓶中，按照ISO文件要求(試樣表面積/浸提介質(zhì)=3 cm2/ml),加入生理鹽水，放在37℃培養(yǎng)箱中浸提72 h,得到可降解生物鎂合金浸提液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1皮膚過敏試驗(yàn) 將40只豚鼠按體重性別隨機(jī)分成3組：實(shí)驗(yàn)組即可降解鎂合金浸提液組20只、陽性對(duì)照組為2,4-二硝基氯苯組10只、陰性對(duì)照組即生理鹽水組10只，每組豚鼠雌雄各半。致敏：將實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物背部左側(cè)脫毛備皮，去毛區(qū)每側(cè)約3 cm×4 cm。24 h后將浸提液滴于紗布上制成的敷貼貼于去毛區(qū)皮膚上，用無刺激性膠布和固定帶固定6 h，第7、14天以同樣方法將浸提液紗布敷貼于豚鼠左側(cè)背部〔19～21〕。用生理鹽水作為陰性對(duì)照，陽性對(duì)照組采用2,4-二硝基氯苯配制成1%的致敏濃度，按照上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。激發(fā)：第28天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物背部同樣方法右側(cè)脫毛備皮，24 h后將浸提液紗布敷貼于去毛區(qū)皮膚上，固定6 h后去除敷貼片，用蒸餾水清洗給藥部位后24、 48、 72 h觀察豚鼠皮膚局部過敏反應(yīng)情況；陽性對(duì)照組用2,4-二硝基氯苯配制成0.1%的激發(fā)濃度，陰性對(duì)照組用生理鹽水，方法同上〔21〕。根據(jù)皮膚過敏反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，按致敏率判斷其致敏強(qiáng)度，過敏率=(組內(nèi)出現(xiàn)過敏反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)/該組動(dòng)物總數(shù))×100%。

1.3.2體外溶血性試驗(yàn) 取日本大耳家兔血約10 ml，放在裝有玻璃珠的三角瓶中，振搖10 min后將纖維蛋白原去除，制備為脫纖血液，用氯化鈉注射液清洗血細(xì)胞，后以2 500 r/min離心5 min至上清液呈無色透明，再將所得紅細(xì)胞用氯化鈉注射液配成2%的混懸液，取7支試管并依次編號(hào)，1～5號(hào)管為供試品管，6號(hào)管為陰性對(duì)照管，第7管為陽性對(duì)照管，依次加入2%紅細(xì)胞混懸液和生理鹽水或蒸餾水〔21〕。將各管輕輕搖勻后，放置于37℃恒溫水浴中并記錄30 min及1、2、3、4 h的結(jié)果。結(jié)果評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：①溶血：溶液呈透明紅色；②紅細(xì)胞凝聚：溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀；③無溶血：紅細(xì)胞全部下沉，上層液無色澄清。

2 結(jié) 果

2.1豚鼠皮膚過敏試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組在去除敷料后24、48、72 h的觀察結(jié)果均為皮膚無明顯改變，無紅斑及水腫；陽性對(duì)照組在去除敷料后均不同程度出現(xiàn)紅斑及水腫。實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的皮膚致敏反應(yīng)計(jì)分均為0,致敏率為0；陽性對(duì)照組致敏率為100%,表明其具有極強(qiáng)致敏性。

2.2體外溶血性試驗(yàn) 蒸餾水組溶液呈透明紅色，表明其發(fā)生了溶血；生理鹽水及生物鎂合金浸提液組均可見紅細(xì)胞全部下沉，上層液無色澄明，未見棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，二者在觀察期內(nèi)均無溶血及紅細(xì)胞凝聚，表明降解生物鎂合金浸提液對(duì)家兔紅細(xì)胞無溶血作用。

3 討 論

目前全球冠心病患病率逐年增加，血管支架植入被認(rèn)為是最重要、最有效的心血管疾病診療技術(shù)。臨床醫(yī)療界對(duì)血管支架的需求推動(dòng)了支架類產(chǎn)品的發(fā)展創(chuàng)新。傳統(tǒng)不可降解金屬支架及藥物洗脫支架存在長期植入引起的慢性炎癥、支架內(nèi)再狹窄、晚期支架血栓等弊端，可降解支架具有克服上述問題的潛在優(yōu)勢，在未來心血管疾病方面將發(fā)揮重要作用，因此作為新一代血管支架已得到人們廣泛關(guān)注。因其直接關(guān)系到使用者的生命安全，其安全性問題更加引起民眾的關(guān)注。因此，對(duì)其安全性評(píng)價(jià)尤為重要。

鎂是人體所必需的一種微量元素，是人體中幾種酶的必需元素，是ATP 酶的輔因子， 它具有穩(wěn)定細(xì)胞膜和影響神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能，與生命的維持、身體的健康有著極其密切的關(guān)系，而且參與心血管活動(dòng)的多個(gè)過程，主要為抗心律失常、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，其抗心律失常作用常被應(yīng)用于臨床治療急性心肌梗死。主要機(jī)制如下：鎂離子和鈣離子相互拮抗，通過競爭離子通道和特定結(jié)合位點(diǎn)，鎂離子可以抑制其進(jìn)出肌質(zhì)的活性，從而抑制心肌細(xì)胞線粒體鈣離子過載引起的心律失常；鎂可以減少冠狀動(dòng)脈痙攣從而改善局部心肌血流，此外鎂影響血液凝固，抑制血小板聚集，降低高密度脂蛋白含量，抑制脂質(zhì)在動(dòng)脈壁的沉積從而預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化〔22〕。然而，純鎂化學(xué)性質(zhì)活潑，在體內(nèi)降解速率過快，鎂合金則兼具優(yōu)良的機(jī)械性能和可調(diào)控降解的特性，溶出的金屬離子還可以被生物體吸收或排泄，最終在人體完成自身修復(fù)時(shí)完全降解消失〔23〕，人們開始探索將可降解生物鎂合金用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本文結(jié)果顯示生物鎂合金浸提液，對(duì)皮膚無潛在致敏性，對(duì)家兔紅細(xì)胞也無溶血作用，說明可降解生物鎂合金支架是一種很有前途的生物可降解支架醫(yī)用材料。