蛇床子素對(duì)髓核致炎神經(jīng)根痛大鼠脊髓背角p38 MAPK表達(dá)的影響

張嘉明，易增興，林世清，王益敏,5，蔡 哲，魏 明，孫來保，鄒學(xué)農(nóng)

(1.惠州市中大惠亞醫(yī)院麻醉科，廣東 惠州 516081；2.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院藥學(xué)教研室，江西 宜春 336000；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510080；4.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院脊柱外科，廣東 廣州 510080；5.廣東省骨科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510080)

慢性腰腿痛是導(dǎo)致勞動(dòng)力喪失的主要疾病，給社會(huì)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。椎間盤突出髓核的生化致炎特性作用是引起周圍神經(jīng)根炎癥，并引起慢性腰腿痛的主要原因，因此也成為當(dāng)前腰椎間盤突出癥發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。p38促分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)、白介素-18(interleukin-18, IL-18)及其受體(interleukin-18 receptor, IL-18R)的激活是導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛和炎癥性疼痛的關(guān)鍵因素，并且它們之間存在著密切聯(lián)系[1]。在腰椎間盤突出癥導(dǎo)致腰腿痛的發(fā)病機(jī)制中，它們是否具有類似的效應(yīng)，目前尚未闡明。臨床實(shí)踐表明，抑制炎癥反應(yīng)是治療腰腿痛的重要措施。

中藥單體蛇床子素(osthole, Ost)又名歐芹酚甲醚或甲基歐芹酚，能有效減輕由椎間盤突出誘發(fā)的急、慢性腰腿痛，但具體機(jī)制尚不清楚。本課題組前期研究提示，Ost能通過抑制髓核致炎神經(jīng)根痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)NOS、COX-2、降鈣素基因相關(guān)肽受體1、3型酸敏感離子通道等的表達(dá)，抑制炎性痛的外周敏化，提高大鼠50%機(jī)械性撤足閾值(mechanical withdrawl threshold，MWT)，從而達(dá)到緩解神經(jīng)根痛覺過敏的作用[2-6]，但是它能否抑制炎癥在脊髓背角內(nèi)的中樞敏化效應(yīng)，值得我們進(jìn)一步探討。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)♂成年SD大鼠156只，體質(zhì)量(235±15)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002。分籠飼養(yǎng), 室溫(20±2)°C , 維持大鼠12 h/12 h晝夜交替(每天8 ∶00～20 ∶00光照)。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守中山大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用的規(guī)定。

1.2試劑與儀器蛇床子素(廣州展晨生物科技有限公司)，用100 mL·L-1二甲亞砜(DMSO，Sigma，USA)溶解；兔抗鼠IL-18一抗(DF6252，Affinity，USA)；兔抗鼠IL-18R一抗(A1414，Santa Cruz, USA)；兔抗鼠p-p38 MARK一抗(Thr180，Affinity，USA)。Frey 纖毛儀(Stoelting 公司，USA)；冰凍組織包埋機(jī)(美國Thermo公司)；倒置熒光顯微鏡(美國Sakura公司)；顯微照相系統(tǒng)(日本NIKON公司)。

1.3動(dòng)物模型建立、分組及處理

1.3.1動(dòng)物模型建立 參照文獻(xiàn)建立動(dòng)物模型[6]，質(zhì)量濃度為35 g·L-1的水合氯醛麻醉大鼠(3.5 mL·kg-1，腹腔注射), 固定大鼠，手術(shù)區(qū)備皮后消毒鋪巾，以兩側(cè)髂嵴最高點(diǎn)連線中點(diǎn)做30 mm左右正中切口，暴露皮膚組織和肌肉，關(guān)節(jié)定位后，分別咬除左側(cè)L5下關(guān)節(jié)突、L6上關(guān)節(jié)突和L5半椎板，暴露左側(cè)L5背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)。從L5半椎板切除處將 PE-10導(dǎo)管向頭側(cè)硬膜外腔輕柔置入約4 mm，并將其固定于同側(cè)肌肉組織，另一端經(jīng)皮下隧道從兩耳之間引出，回抽無血和腦脊液流出，電凝灼燒封管固定，充分止血后，無菌生理鹽水沖洗傷口。消毒鼠尾，20 G針頭沿錐體間隙刺取近端2個(gè)節(jié)段自體髓核組織(約0.4 mg)，置于L5DRG周圍。止血充分后逐層縫合傷口，聚維酮碘軟膏擦拭縫合皮膚。Sham組取尾部自體髓核組織，但不將其置于L5DRG部位，其余操作同上。

1.3.2分組及處理 SPF級(jí)成年♂SD大鼠156只，分為Blank組(n=36)、假手術(shù)組(Sham組，n=36)、模型組(NP組，n=36)、溶劑對(duì)照組(DMSO組，n=24)和蛇床子素組(Ost組，n=24)。術(shù)后d 2，DMSO組給予100 mL·L-1DMSO，Ost組給予20 g·L-1蛇床子素，1 min內(nèi)注射完，注射完畢后用100 mL·L-1DMSO溶液10 μL沖盡導(dǎo)管內(nèi)殘留藥液。將手術(shù)日記為d 0，各組大鼠分別于術(shù)前1 d(d-1)，術(shù)后1天(d 1)、2天(d 2)、6天(d 6)、7天(d 7)、12天(d 12)、14天(d 14)、21天(d 21)和28天(d 28)測定50% MWT。給藥后5天(d 7)和第12天(d 14)取術(shù)側(cè)脊髓背角，用Western blot法檢測p38 MAPK、IL-18和IL-18R的蛋白相對(duì)濃度。qPCR法測定IL-18 mRNA表達(dá)量。

1.4測定50%MWT建模前，每日9 ∶00～16 ∶00將大鼠放于透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)自由活動(dòng)，以適應(yīng)測試環(huán)境，并于術(shù)前1 d測定大鼠的基礎(chǔ)縮足閾值。術(shù)后行為學(xué)測試也在該時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行，測試前，大鼠預(yù)先在玻璃箱中適應(yīng)30 min，待其安靜后再進(jìn)行測試。檢測50% MWT：大鼠置于玻璃箱內(nèi)，安靜后以不同強(qiáng)度的von Frey纖毛刺激大鼠足心部皮膚，避開肉墊使之稍成S形，持續(xù)6 ～ 8 s。若大鼠后肢出現(xiàn)迅速抬起、畏縮、撤回或舔舐足底，則認(rèn)為是陽性反應(yīng)。以2 g為初始刺激強(qiáng)度, 當(dāng)該強(qiáng)度刺激不能引起陽性反應(yīng)，則給予相鄰大一級(jí)強(qiáng)度刺激；若有陽性反應(yīng)則給予相鄰小一級(jí)強(qiáng)度的刺激，每個(gè)強(qiáng)度重復(fù)刺激5次，如此連續(xù)進(jìn)行，將出現(xiàn)3次以上陽性反應(yīng)的最小von Frey纖維強(qiáng)度定為大鼠的50% MWT。相鄰2次刺激至少間隔約15 s，每次刺激前大鼠均處于安靜狀態(tài)。

1.5Westernblot法檢測p38、IL-18和IL-18R的蛋白相對(duì)濃度深麻醉下取出大鼠術(shù)側(cè)腰段L4～6脊髓背角，用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗2 ～ 3次，去除污血，剪成小塊置于勻漿器中。加入10倍于組織體積的組織蛋白提取試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)，冰浴徹底勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，振蕩。冰浴30 min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保勻漿液完全裂解，4°C、12 000 r·min-1離心5 min，收集上清。SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)膜，接著用5%脫脂牛奶封閉1 h，除去封閉液，加入兔抗鼠p-p38 MAPK一抗(1∶1 000)、兔抗鼠IL-18一抗(1∶1 000)、兔抗鼠IL-18R(1∶200)，4°C孵育過夜。用TBS洗膜3次，每次5 min。再加入稀釋好的二抗(1∶2 500)，室溫下孵育30 min。將膜蛋白面?zhèn)扰c新鮮配制的ECL試劑反應(yīng)后，依次壓片、顯影、定影。用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。將每次實(shí)驗(yàn)中各樣品灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值相除，得到每個(gè)樣品的蛋白相對(duì)含量。

1.6qPCR法測定IL-18mRNA表達(dá)量取大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角組織，按TRIzol 抽提法提取總RNA，紫外吸收測定法檢測RNA 濃度和純度。取適量RNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，-20℃保存待用。采用Primer 5.0 設(shè)計(jì)基因特異性引物，IL-18引物序列：5′-TGGGATTCGTTGGCTGTT-3′(上游)，5′-AGACCACTTTGGCAGACTTCA-3′(下游)；內(nèi)參β-actin引物序列：5′-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3′(上游)，5′-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3′(下游)，上述引物均由上海生物工程公司合成。RT-PCR 50 μL反應(yīng)體系：SYBR Green染料10 μL，上游引物1 μL，下游引物 1 μL，dNTP 1 μL，Taq聚合酶2 μL，待測樣品cDNA 5 μL，ddH2O 30μL。將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Real time PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93°C 2 min預(yù)變性，然后93°C 變性1 min，退火55 °C 1 min，延伸72°C 1 min，共40個(gè)循環(huán)，最后72°C 7 min延伸。運(yùn)用Bio-Rad CFX 96熒光定量PCR儀配套的Bio-Rad CFX Manager Software1.6數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，以IL-18 mRNA/β-actin mRNA的2-ΔΔCt值的比值作為IL-18 mRNA的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠給予Ost前后50%MWT的測試結(jié)果各組大鼠術(shù)前的50% MWT比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。與Blank組比較，Sham組大鼠的50% MWT在術(shù)后d 1有所下降(P<0.05)，隨后逐漸恢復(fù)至術(shù)前水平；NP組、Ost組和DMSO組大鼠在術(shù)后的d 1即出現(xiàn)50% MWT下降(P<0.05)，其中NP組和DMSO組大鼠持續(xù)降低至術(shù)后28 d，3組大鼠在給Ost前50% MWT無明顯差異(P>0.05)。給予相應(yīng)藥物后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，與DMSO組比較，Ost組50% MWT升高(P<0.05)；DMSO組50% MWT在給藥前后無明顯變化(P>0.05)，與NP組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見Fig 1。

Fig 1 Comparison of 50% MWT before andafter epidural injection of drug

*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsDMSO group;△P<0.05vssame group (before application of drug)

2.2給予Ost后d5各組大鼠脊髓背角p-p38蛋白表達(dá)的變化給藥后5 d，與Blank組比較，Sham組、NP組、DMSO組和Ost組p-p38蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與DMSO組相比，Ost組p-p38蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，NP組與DMSO組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見Fig 2。

Fig 2 Expression of p-p38 in different groupsafter epidural application of drug

A:The expression levels of p-p38 protein in the spinal dorsal horn of rats were analyzed by Western blot; B: Relative expression of p-p38 protein in the spinal dorsal horn of rats.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsDMSO group

2.3給予Ost后5d各組大鼠脊髓背角IL-18蛋白表達(dá)的變化給予Ost后5 d，與Blank組比較，Sham組、NP組、DMSO組、Ost組給藥后d 5 IL-18蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與DMSO組相比較，Ost組IL-18蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，NP組與DMSO組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見Fig 3。

2.4給予Ost后12d各組大鼠脊髓背角IL-18R蛋白表達(dá)的變化給予Ost后12 d，與Blank組相比，Sham組、NP組、DMSO組、Ost組術(shù)后d 14 IL-18蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與DMSO組相比較，Ost組IL-18R蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，NP組與DMSO組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見Fig 4。

2.5給予Ost后5d各組大鼠脊髓背角IL-18mRNA表達(dá)的變化給予Ost后5 d，與Blank組和Sham組相比，NP組、DMSO組、Ost組術(shù)后d 7 IL-18 mRNA表達(dá)量升高(P<0.05)。與DMSO組相比較，Ost組IL-18 mRNA表達(dá)量降低(P<0.05)，NP組與DMSO組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見Fig 5。

Fig 3 Expression of IL-18 in different groupsafter epidural application of drug

A:The expression levels of IL-18 protein in the spinal dorsal horn of rats were analyzed by Western blot; B: Relative expression of IL-18 protein in the spinal dorsal horn of rats.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsDMSO group

2.6各組大鼠脊髓背角p-p38MAPK與IL-18mRNA的相關(guān)性分析術(shù)后d 7將各組大鼠脊髓背角表達(dá)的p-p38 MAPK蛋白相對(duì)濃度與IL-18 mRNA含量進(jìn)行Spearman 秩相關(guān)分析，p-p38 MAPK與IL-18 mRNA秩相關(guān)系數(shù)R=0.9，提示各組大鼠兩者之間的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)。

3 討論

MAPKs的激活在哺乳動(dòng)物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用，可引發(fā)疼痛的外周敏化和中樞敏化，一定程度上加劇了傷害后所導(dǎo)致的痛覺過敏[7]，而p38 MAPK信號(hào)通路是MAPKs家族中重要的一條分支，一般由細(xì)胞應(yīng)激和促炎因子激活。靜脈或鞘內(nèi)注射p38抑制劑已被證明能有效緩解炎癥和關(guān)節(jié)炎[8]。有研究認(rèn)為，p38MAPK調(diào)控的下游靶基因主要有ICAM-1、IL-1、TNF-α、COX-2等，該通路與腰椎間盤退變和根性癥狀密切相關(guān)[9]。本實(shí)驗(yàn)采用我們團(tuán)隊(duì)前期成功改良的非壓迫性髓核致炎大鼠疼痛的標(biāo)準(zhǔn)化模型[6]，檢測顯示，在建立模型后d 7，NP組大鼠p-p38表達(dá)含量上調(diào)，這與Seki等[10]研究結(jié)果一致，提示了p38的磷酸化激活很可能參與了髓核致炎的致痛過程。而作為IL-1家族成員之一的IL-18，在神經(jīng)病理性疼痛和腰椎間盤突出誘發(fā)坐骨神經(jīng)痛的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。IL-18致炎效應(yīng)可能與以下機(jī)制有關(guān)[11]：① 促進(jìn)淋巴T細(xì)胞增殖；② 誘發(fā)粒-巨噬細(xì)胞集落刺激物、IL-8、單核細(xì)胞趨化物質(zhì)-1及巨噬細(xì)胞炎癥物質(zhì)-1等；③ 通過MAPK途徑發(fā)揮致炎作用。在本實(shí)驗(yàn)建立模型后的d 7，NP組大鼠IL-18蛋白及mRNA表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致大鼠機(jī)械性痛閾值下降。表明脊髓背角中的IL-18很有可能參與了髓核致炎神經(jīng)根疼痛的過程。

Fig 4 Expression of IL-18R in different groupsafter epidural application of drug

A:The expression levels of IL-18R protein in the spinal dorsal horn of rats were analyzed by Western blot; B: Relative expression of IL-18R protein in the spinal dorsal horn of rats.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsDMSO group

Fig 5 Relative expression of IL-18 mRNA in different groupsafter epidural application of drug

*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsDMSO group

在衣原體誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，有激活的IL-18與IL-1β表達(dá)，而給予p38 MAPK抑制劑后能夠明顯抑制它們的表達(dá)，證明了IL-18 與IL-1β是通過激活p38 MAPK通路而發(fā)揮致炎作用[12]。在一項(xiàng)神經(jīng)病理性疼痛模型研究中[13]，結(jié)扎L5背根神經(jīng)后可誘發(fā)大鼠機(jī)械性痛覺過敏，術(shù)后d 1開始出現(xiàn)大鼠脊髓背角內(nèi)IL-18蛋白表達(dá)上調(diào)，術(shù)后d 7 IL-18R蛋白表達(dá)升高，其表達(dá)的時(shí)間與我們結(jié)果不同，可能是神經(jīng)結(jié)扎后的炎癥反應(yīng)在更早期即可形成。另外，該模型中，脊髓背角中的p38 MAPK激活誘發(fā)了IL-18蛋白表達(dá)上調(diào)。在給予p38 MAPK通路特異性抑制劑SB203580后，IL-18蛋白明顯下降，同時(shí)伴有IL-18R蛋白下降，說明IL-18發(fā)揮作用可能與p38 MAPK通路表達(dá)密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在建立了穩(wěn)定的髓核致炎疼痛模型后，p-p38和IL-18 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，對(duì)p-p38MAPK與IL-18 mRNA表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者呈正相關(guān)關(guān)系。因此，IL-18 mRNA與p38 MAPK可能存在上下游信號(hào)通路關(guān)系。我們推測，在髓核致炎神經(jīng)根痛大鼠的炎癥發(fā)生早期，p38 MAPK通路激活后，可通過調(diào)控IL-18 mRNA基因表達(dá)，產(chǎn)生IL-18炎癥介質(zhì)形成炎癥反應(yīng)，到中晚期出現(xiàn)IL-18R蛋白表達(dá)。p38 MAPK信號(hào)通路及相關(guān)炎癥因子IL-18和IL-18R的激活，共同介導(dǎo)了髓核致炎大鼠神經(jīng)根較長時(shí)間的炎性疼痛。

在治療腰椎間盤突出癥的中藥中，獨(dú)活寄生湯具有安全有效的療效，口服配合中藥離子導(dǎo)入治療腰椎間盤突出癥可以有效緩解患者臨床癥狀和體征，明顯降低患者體內(nèi)IL-6、IL-8及TNF-α的表達(dá)，從而緩解疼痛[14]。該方劑的主要成分是蛇床子，其主要的藥用活性成分是蛇床子素?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其抗炎效果及機(jī)制相對(duì)廣泛[15]：① 通過抑制肥大細(xì)胞Ca2+通道，減少Ca2+內(nèi)流，從而減少組織胺釋放，穩(wěn)定其細(xì)胞膜而發(fā)揮止癢作用；② 可直接抑制CNS發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用，其本身化學(xué)結(jié)構(gòu)具有一定的局麻作用；③ 增強(qiáng)中樞神經(jīng)的突觸傳遞，促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶；④ 抗衰老、抗氧化作用。在機(jī)械性腦損傷炎癥動(dòng)物模型中，蛇床子素還可以抑制細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)，從而修復(fù)腦損傷等神經(jīng)系統(tǒng)難治性疾病[16]。除了上述藥理學(xué)效應(yīng)，Ost的鎮(zhèn)痛作用也非常突出，可明顯抑制急性和慢性炎癥反應(yīng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Ost具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛效應(yīng)，它能抑制髓核致炎大鼠背神經(jīng)節(jié)內(nèi)COX-2、CGRPR1、ASIC3的表達(dá)，還能通過抑制脊髓背角內(nèi)ERK通路，降低下游COX-2 mRNA的表達(dá)，從而減輕神經(jīng)元的興奮性，抑制疼痛的外周敏化和中樞敏化，減弱大鼠的機(jī)械性和熱覺敏感性刺激[2-6, 17 ]。本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)谛g(shù)后d 2經(jīng)硬膜外導(dǎo)管給予Ost 1mg/rat，可改善大鼠自身髓核誘發(fā)的機(jī)械性痛敏；在術(shù)后d 7，Ost組大鼠脊髓背角p-p38和IL-18蛋白及IL-18 mRNA均發(fā)生下調(diào)；在術(shù)后d 14，IL-18R蛋白的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)。我們認(rèn)為是由于蛇床子素在炎癥發(fā)生的早期通過下調(diào)p-p38和IL-18等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，從而抑制疼痛的外周敏化，而在炎癥發(fā)生中晚期下調(diào)IL-18R蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步阻斷了炎癥向中樞傳遞，抑制了炎癥的中樞敏化效應(yīng)。正是由于Ost可在炎癥發(fā)生的不同時(shí)期抑制炎癥介質(zhì)表達(dá)，使得術(shù)后大鼠的機(jī)械性痛敏能得到持續(xù)性緩解。

綜上所述，脊髓背角p38 MAPK信號(hào)相關(guān)通路參與了髓核致炎大鼠神經(jīng)根痛，在疼痛形成早期IL-18為主要炎癥參與介質(zhì)，在中晚期IL-18R為炎癥主要參與受體。術(shù)后單次硬膜外腔注射Ost可能通過抑制脊髓背角p-p38、IL-18、IL-18R蛋白和IL-18 mRNA的過度表達(dá)，從而有效緩解髓核致炎大鼠神經(jīng)根痛覺過敏。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)研究在廣州市中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科研究所完成，感謝各位老師和實(shí)驗(yàn)室同事對(duì)本實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和幫助！)

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