鄧六勤,黎梅桂,吳寶儀
(廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心,廣東廣州510000)
黃芪為豆科植物膜莢黃芪、蒙古黃芪、多序巖黃芪或紅芪的干燥根,味甘,性微溫,具有補(bǔ)氣固表、利水退腫、脫毒排膿、生肌等功效[1]?,F(xiàn)代藥理研究表明,黃芪具有調(diào)節(jié)免疫、增強(qiáng)體質(zhì)、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤及改善心肌缺血等功能[2-4]。黃芪的主要化學(xué)成分有黃酮類、皂苷類、黃芪多糖、氨基酸等[5],黃芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)是黃芪中最主要的活性成分[6],具有增強(qiáng)機(jī)體抵抗力,促進(jìn)抗體生成,增強(qiáng)免疫力,雙向調(diào)節(jié)血糖和保護(hù)心血管系統(tǒng)等作用[7-8],目前廣泛用于中醫(yī)臨床制劑和動(dòng)物飼料[9]。黃芪多糖的組成較復(fù)雜,其相對分子質(zhì)量為10~50 kD[10]。黃芪多糖具有一定的生物學(xué)活性,但由于其相對分子質(zhì)量大,溶解性差,不易被吸收,故在應(yīng)用方面受到很大限制。李紅法等[11]采用乙醇分級沉淀法提取黃芪多糖,獲得了不同相對分子質(zhì)量的黃芪多糖,表明隨著黃芪多糖相對分子質(zhì)量的降低,抗氧化活性增強(qiáng)。故采用適宜的方法將黃芪多糖相對分子質(zhì)量降低,有助于提高其生物活性。本研究中采用維生素C(Vit C)和過氧化氫體系誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基降解黃芪多糖,制備低相對分子質(zhì)量黃芪多糖,并研究其抗氧化、抗腫瘤活性,為探討低相對分子質(zhì)量黃芪多糖在抗腫瘤藥物和保健食品中的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)?,F(xiàn)報(bào)道如下。
儀器:T1000型電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠);HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海-恒科技有限公司);Eyela N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司);OSB-2100型油浴鍋(上海愛朗儀器有限公司);SHB-3型循環(huán)水多用真空泵(鞏義市予華儀器有限公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱;顯微鏡;酶標(biāo)儀(Bio-Rad Inc.USA)。
試藥:FeCl2·4H2O(天津市大茂化學(xué)廠,批號為20151220);H2O2(天津市大茂化學(xué)廠,批號為20160720);水楊酸(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司,批號為20150208);鄰苯三酚(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司,批號為20160315)。以上試劑均為分析純。去離子水(實(shí)驗(yàn)室自制);黃芪購買于清平中藥材市場,經(jīng)鄧六勤副主任中藥師鑒定為中藥黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge。藥材打粉后,過4號篩,備用。
1.2.1 鐵皮石斛粗多糖的提取分離
取黃芪粉末約100 g,精密稱定,用石油醚回流提取2 h,過濾,棄去濾液,濾渣重新用80%乙醇回流提取2 h,除去可溶性雜質(zhì),包括色素、游離糖等。處理后的黃芪粉末加入去離子水,回流提取2 h,連續(xù)提取3次,合并濾液。合并的濾液以4 000 r/min的速率離心10 min。減壓濃縮上清液,濃縮液加入4倍體積的無水乙醇,低溫冷藏,靜置過夜。離心,沉淀置60℃的烘箱中烘干。用熱水溶解烘干的粗多糖,用Sveag法脫蛋白,重復(fù)3~5次。脫蛋白后的多糖用無水乙醇沉淀,靜置過夜,離心,60℃烘干,得到黃芪粗多糖。
1.2.2 H2O2-Vit C-Fe2+氧化降解粗多糖的提取
稱取1.2.1項(xiàng)下得到的粗多糖3.2 g,置500 mL錐形瓶中,加320 mL純水使其溶解,加入新鮮配制的不同量的100 mmol的Vit C,1 000 mmol的FeCl2·4H2O,1 000 mmol H2O2,置暗處反應(yīng)2 h。然后將反應(yīng)液置于300Da透析袋中,在純水中透析2 d,透析液以7000r/min的速率離心10 min,冷凍干燥上清液,得不同降解片段的粗多糖。
1.2.3 多糖相對分子質(zhì)量測定
黃芪多糖降解片段樣品及標(biāo)準(zhǔn)多糖Dextran standard系列樣品分別經(jīng)高效液相凝膠滲透色譜(HPGPC)分析,所用儀器為Agilent 1100 series型高效液相色譜(HPLC)主機(jī),配置示差折光檢測器,分析柱為TSK G4000PWXL(300 mm×7.5 mm)和TSK G5000PWXL(300 mm×7.8 mm)串聯(lián)柱樣品質(zhì)量濃度為1.5 g/L;進(jìn)樣量為20 μL;流動(dòng)相為醋酸鈉;檢測器靈敏度為4;柱溫為40℃;流速為0.6 mL/min。葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(相對分子質(zhì)量1 270,5 220,11 600,23 800,48 600,80 900,147 600,273 000,409 800,667 800)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.4 抗氧化活性測定
對O2·的清除作用:取5 g/L的多糖樣品溶液50 μL,125 μL Tris緩沖液,25 μL鄰苯三酚,迅速混勻,于325 nm波長下測定吸光度(A),每30 s測1次,連續(xù)測5 min,以水代替樣品測A0,ΔA為線性回歸方程的回歸系數(shù)。清除率=(1-ΔA/ΔA0)×100%。
對·OH的清除作用:取2 mL不同質(zhì)量濃度(0.5,1,2,3,5 g/L)的多糖樣品與2 mL 6 mmol/L FeSO4,2 mL 2.4 mmol/L H2O2混合,搖勻,靜置10 min,再加入6 mmol/L的水楊酸2 mL,搖勻,37℃水浴30 min,4 000 r/min離心10 min,上清液于510 nm波長處測定Ai,用1 mL水代替樣品測定A0,用2 mL水代替H2O2溶液測定Aj。清除率=[1-(Ai-Aj)]/A0×100%。
1.2.5 體外抗腫瘤活性測定
細(xì)胞株及培養(yǎng)條件:人肝癌細(xì)胞株HepG-2常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中,37℃,5%CO2,培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3 d換液1次,取對數(shù)生長期細(xì)胞用于試驗(yàn)。
MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率:細(xì)胞以5×104/孔接種于96孔板,置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,次日細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液,加入質(zhì)量濃度為10,25,50,100,400 μg/mL的黃芪多糖培養(yǎng)液100 μL,每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)5孔,同時(shí)設(shè)無藥陰性對照組5孔,以及陽性對照組5-氟尿嘧啶(5-FU),質(zhì)量濃度為100 μg/mL,設(shè)5孔;然后置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24,36,48 h;取出后加入5 g/L的MTT溶液20 μL,37℃避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h;每孔加二甲基亞砜(DMSO)150 μL,震蕩10 min,混勻使甲瓚結(jié)晶充分溶解;置酶標(biāo)儀490 nm波長下檢測各孔吸光度(OD),取5個(gè)復(fù)孔的均值為最終結(jié)果;計(jì)算細(xì)胞抑制率,細(xì)胞抑制率=(陰性對照組OD值-多糖組OD值)/陰性對照組OD值×100%。
黃芪粗多糖用不同質(zhì)量濃度的H2O2-Vit C-Fe2+氧化降解后,共得到6個(gè)降解片段,冷凍干燥后稱定質(zhì)量。不同相對分子質(zhì)量多糖片段的降解方法和得率見表1。
系列相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品的HPGPC分析保留時(shí)間見表2。以保留時(shí)間計(jì)算各自的分配系數(shù)(Kaw)作橫坐標(biāo)、相對分子質(zhì)量為縱坐標(biāo),線性回歸方程為Y=-0.3109X+13.148(R2=0.994 5)。黃芪粗多糖及其降解片段洗脫峰型對稱,由線性回歸方程及樣品保留時(shí)間可計(jì)算出黃芪多糖相對分子質(zhì)量結(jié)果為:粗多糖269 459.60 u,片段1為74 446.11 u,片段2為105 006.92 u,片段3為167 793.73 u,片段4為87 565.35 u,片段5為133 226.45 u,片段6為96 574.76 u。
表1 氧化降解因素水平表
表2 標(biāo)準(zhǔn)品的HPGPC分析保留時(shí)間
2.3.1 對羥基的清除作用
黃芪粗多糖及其降解片段對·OH的清除作用效果見圖1 A。線性范圍為0.5~5.0 g/L,陽性藥Vit C對·OH的清除效果非常明顯,清除率近100.00%。由圖1 A可見,粗多糖和6個(gè)降解片段對羥基的清除能力均隨質(zhì)量濃度的增高而增大,5 g/L片段1清除率已超過60%。降解片段1~6和降解前的粗多糖的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為1.669,7.043,12.742,2.428,9.641,2.573 g/L。6個(gè)降解片段的清除效果均比粗多糖好,且清除作用1>4>6>5>2>3。
2.3.2 對超氧基的清除作用
黃芪粗多糖及其降解片段對O2·的清除作用效果見圖1 B。線性范圍為0.5~5.0 g/L,陽性藥Vit C對O2·的清除效果非常明顯,清除率趨近100.00%。由圖1 B可見,黃芪多糖對O2·的清除作用較弱。黃芪粗多糖降解前對O2·的清除率在質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí)為40.1%。降解后的多糖片段清除作用有所增強(qiáng),片段1在質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí)清除率達(dá)66.4%。降解片段1,4,6清除作用明顯優(yōu)于粗多糖,也比片段2,3,5清除效果好??梢?,6個(gè)降解片段的清除效果均比粗多糖好。
圖1 黃芪粗多糖及其降解片段清除作用
體外抗腫瘤活性采用MTT法評價(jià)。陽性對照藥為5-Fu,24,48 h時(shí)的抑制率為51.32%和61.47%,檢測正常,可作為比較。黃芪粗多糖及其降解片段1,4,6清除自由基的能力較強(qiáng),故抗腫瘤活性選擇片段1,4,6作進(jìn)一步研究。在質(zhì)量濃度為50~800 μg/mL范圍內(nèi)處理HepG-2,分別于24,48 h時(shí)測定對HepG-2的生長抑制作用,細(xì)胞存活率見圖2??梢?,黃芪多糖對HepG-2的生長抑制存在濃度依賴性,隨著給藥質(zhì)量濃度的增大,細(xì)胞活性降低。
由圖2可見,給藥48 h比給藥24 h時(shí)抑制作用強(qiáng),說明黃芪多糖對HepG-2抑制作用存在時(shí)間依賴性。降解片段1對HepG-2抑制作用較突出,24 h時(shí)和48 h時(shí)的抑制作用均比其他多糖強(qiáng),48 h時(shí)在給藥質(zhì)量濃度為800 μg/mL時(shí),其抑制率達(dá)57%。雖然降解片段6在800 μg/mL時(shí)略微低于粗多糖,該給藥質(zhì)量濃度非常高,但差異不明顯??梢?,無論是24 h時(shí)還是48 h時(shí),各給藥質(zhì)量濃度下,黃芪多糖降解片段均表現(xiàn)出更好的抗HepG-2活性,高于降解前的粗多糖的活性。
圖2 不同濃度的黃芪多糖對HepG-2細(xì)胞的抑制效果
多糖是來源于高等植物、動(dòng)物細(xì)胞膜及微生物細(xì)胞壁中的一類天然大分子,是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一,廣泛參與細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、再生等各種生命現(xiàn)象。現(xiàn)代藥理研究表明,多糖具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)血脂、增強(qiáng)免疫等生物活性,且來源廣泛,不良反應(yīng)少,在食品和新藥研發(fā)領(lǐng)域已受到越來越多的關(guān)注。
目前,國內(nèi)外學(xué)者提出的多糖降解方法主要分為化學(xué)降解法、物理降解法和生物降解法[12]。多糖在氧化劑的存在下可進(jìn)行氧化降解,用H2O2氧化降解多糖無毒,無副產(chǎn)物,是較理想的化學(xué)降解方法。王琪琳[13]報(bào)道,海帶硫酸多糖可被H2O2有效地降解,降解之后海帶硫酸多糖的多糖含量、硫酸根含量及單糖組成基本無變化。孫利芹等[14]用過氧化氫輔助超聲波降解法制備低相對分子質(zhì)量紫球藻多糖,研究表明,相對分子質(zhì)量小的多糖對自由基有明顯的清除作用,相對分子質(zhì)量對其抗氧化活性有顯著影響。
黃芪的多糖含量超過10%,是其主要成分和活性物質(zhì)。大分子的黃芪多糖雖具有一定的生物活性,但由于其相對分子質(zhì)量大,溶解性較差,生物利用率較低,制約了其藥效發(fā)揮。研究表明,黃芪多糖的生物活性與其相對分子質(zhì)量大小相關(guān)。文獻(xiàn)[12]報(bào)道采用分步醇沉法對黃芪總多糖進(jìn)行分離,結(jié)果顯示,不同相對分子質(zhì)量黃芪多糖均有抗氧化作用,且抗氧化能力與其相對分子質(zhì)量大小有關(guān)。
本研究中,通過氧化降解,使黃芪多糖相對分子質(zhì)量降低,得到6個(gè)不同相對分子質(zhì)量的粗多糖片段。由基體外抗氧化試驗(yàn)表明,黃芪多糖降解后的片段抗氧化活性增強(qiáng),清除羥基的作用比清除超氧基強(qiáng)。然后,用體外抗氧化活性較強(qiáng)的片段進(jìn)行體外抗腫瘤研究,結(jié)果顯示,降解片段對HepG-2抑制作用比降解前的粗多糖強(qiáng)。
黃芪為補(bǔ)氣佳品[15],但目前主要作為茶飲或臨床調(diào)配使用,極少有深加工的保健產(chǎn)品。本研究中采用氧化降解的方法降解黃芪多糖,為尋找多糖生物活性較強(qiáng)適宜的相對分子質(zhì)量范圍,提高黃芪的生物利用度,以及為其他中藥材多糖的降解提供參考。同時(shí),本研究中還發(fā)現(xiàn)黃芪多糖具有一定抗氧化、抗腫瘤作用,提示其可在防衰老、抗腫瘤等方面發(fā)揮作用,進(jìn)一步擴(kuò)大了黃芪的藥用范圍,為黃芪多糖精加工提供理論依據(jù),有望開發(fā)為藥品或多糖保健品,以提高黃芪的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值。
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