洋金花提取物對(duì)單胺氧化酶B的抑制作用研究

李冰+宮彬彬+王亮亮

【摘要】 目的 研究洋金花對(duì)單胺氧化酶B（MAO-B）的抑制效果及抑制類型。方法 采用醇提水沉法對(duì)洋金花不同部位進(jìn)行提取， 獲得提取物， 并計(jì)算得率。利用分光光度法研究了洋金花不同部位提取物對(duì)MAO-B的抑制作用。對(duì)花提取物抑制數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， 求得花提取物對(duì)MAO-B的半數(shù)抑制濃度IC50值。進(jìn)一步對(duì)花提取物抑制MAO-B的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行考察， 根據(jù)雙倒數(shù)曲線結(jié)果判定抑制機(jī)制。結(jié)果 洋金花提取物對(duì)MAO-B有抑制作用， 花部位提取物抑制效果最強(qiáng)， 濃度為1 mg/ml時(shí)， 對(duì)MAO-B的抑制率為（55.74±1.5）%， 半數(shù)抑制濃度IC50為0.75 mg/ml。抑制動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明， 洋金花提取物對(duì)MAO-B的抑制作用屬于混合型抑制。結(jié)論 洋金花提取物對(duì)MAO-B具有明顯抑制作用， 屬于混合性抑制， 這可能是洋金花對(duì)PD具治療作用的機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】 單胺氧化酶B；抑制；洋金花；帕金森病

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.01.118

【Abstract】 Objective To study the inhibitory effect and types of Datura metel L. extract on monoamine oxidase B （MAO）-B. Methods Alcohol extraction water sedimentation method was used to obtain fractions from different parts of Datura metel L.， and the yields of the extracts were calculated. Spectrophotometry was used to study the inhibitory effect of different parts of Datura metel L. on MAO-B. The inhibition data of flower extract were analyzed， and the IC50 value of half inhibitory concentration of flower extract to MAO-B was obtained. The kinetics of MAO-B inhibition was further investigated， and the inhibition mechanism was determined according to the results of the double reciprocal curve. Results The extracts of Datura metel L. had the inhibitory effect on MAO-B， and the extracts of flower parts had the strongest inhibitory effect. The inhibitory rate of MAO-B was （55.74±1.5）% at the concentration of 1 mg/ml and the IC50 was 0.75 mg/ml. Inhibition kinetics showed that the inhibitory effect of Datura metel L. on MAO-B was mixed type inhibition. Conclusion Datura metel L. has obvious inhibitory effect on MAO-B， which belongs to the mixed inhibition. It may be one of the mechanisms of Datura metel L. in healing PD.

【Key words】 Monoamine oxidase B； Inhibitory； Datura metel L.； Parkinsons disease

MAO是位于線粒體外膜上的一種黃素蛋白， 包括單胺氧化酶A（MAO-A）和MAO-B兩種亞型， 能催化多種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)氧化脫氨[1]， 同時(shí)釋放過(guò)氧化氫， 造成細(xì)胞氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是帕金森?。≒arkinsons disease， PD）重要發(fā)病機(jī)制之一[2]， 研究表明， PD發(fā)病與MAO活性異常升高密切相關(guān)[3]。MAO-B抑制劑在治療PD中具有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)， 如長(zhǎng)期使用不會(huì)產(chǎn)生精神障礙、運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥、異動(dòng)癥等不良反應(yīng)[4]。探索和開發(fā)新型的MAO-B抑制劑已經(jīng)成為臨床研究的熱點(diǎn)方向[5]。洋金花（Datura metel L.）又名白花曼陀羅， 為茄科（Solanaceae）曼陀羅屬植物， 主要成分有生物堿類、黃酮類、醉茄內(nèi)酯類、木質(zhì)素類、倍半萜類及酚酸類等， 藥用歷史悠久， 具有平喘止咳、解痙鎮(zhèn)痛[6]、抗驚厥[7]、抗氧化[8] 等功效。藥理活性廣泛， 可用于治療銀屑病[9]、類風(fēng)濕[10]、慢性氣管炎[11]及精神分裂癥[12]等， 也可用于外科麻醉[13]。孫申田等[14]研究表明， 洋金花能有效改善PD患者的臨床癥狀， 對(duì)PD具有一定治療作用， 但并未對(duì)其治療作用機(jī)制進(jìn)行研究。鑒于此， 本文對(duì)洋金花治療PD的機(jī)理進(jìn)行了初步探究， 研究了洋金花提取物對(duì)MAO-B的抑制效果， 并對(duì)其抑制動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1. 1 主要儀器及試劑 UV-5200型紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）、TGL-20M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、RE-3000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。鹽酸司來(lái)吉蘭購(gòu)置于SIGMA公司， 其他試劑均為分析純。endprint

1. 2 實(shí)驗(yàn)材料 曼陀羅采于邢臺(tái)學(xué)院校園北門， 由邢臺(tái)學(xué)院化學(xué)工程與生物技術(shù)學(xué)院唐偉斌教授鑒定。健康Wistar大鼠， 購(gòu)于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 許可證號(hào)：SCXK（冀）2003-1-003。

1. 3 方法

1. 3. 1 植物提取物的制備 將植物材料陰干， 粉碎后過(guò)

80目篩。用索氏提取法以95%的乙醇、90℃回流提取8 h。濾液減壓蒸發(fā)， 加入少量蒸餾水， 超聲震蕩。靜置過(guò)夜后將濾液離心， 棄沉淀取上清。將上清液水浴蒸干， 105℃烘干至恒重。置干燥器中冷卻30 min， 迅速精密稱定重量[15]。測(cè)定得率。

1. 3. 2 MAO的制備與酶活測(cè)定 以Wistar大鼠肝組織為材料提取MAO， 提取方法參考文獻(xiàn)[16]。酶活測(cè)定參照文獻(xiàn)[17]。以MAO-B的特異性底物芐胺制備反應(yīng)體系， 其產(chǎn)物苯甲醛在250 nm處有最大光吸收， 利用分光光度法對(duì)MAO-B酶活進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系為磷酸鉀緩沖液（0.2 M， pH 7.4）， 包含MAO（蛋白濃度為2 mg/ml）， 芐胺。將反應(yīng)體系于37℃孵育1 h。隨后終止反應(yīng)， 測(cè)定酶活。

1. 3. 3 洋金花提取物對(duì)MAO-B的抑制作用 考察洋金花不同部位提取物對(duì)MAO-B的抑制作用。反應(yīng)體系制備同“2.2”， 芐胺濃度固定為其米氏常數(shù)Km（0.1 mM[18] ）， 并向其中加入洋金花不同部位提取物（根、莖、葉、花、果實(shí)、種子）， 終濃度均為1 mg/ml。以不加入植物提取物的反應(yīng)體系為對(duì)照， 分別測(cè)定酶活， 計(jì)算抑制率。

1. 3. 4 洋金花花提取物對(duì)MAO-B的半數(shù)抑制濃度IC50值測(cè)定 反應(yīng)體系制備同“2.2”， 向其中分別加入不同濃度洋金花花提取物（0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml）， 考察對(duì)MAO-B的抑制作用。分析數(shù)據(jù)， 計(jì)算IC50值。

1. 3. 5 洋金花提取物對(duì)MAO-B抑制動(dòng)力學(xué)考察 反應(yīng)體系制備同“2.2”， 向反應(yīng)體系中加入不同濃度芐胺（0.1、0.2、0.4 mM）， 考察不同濃度洋金花提取物（0、1 mg/ml）對(duì)反應(yīng)速率的影響。以吸光度值作為反應(yīng)速率V， 底物芐胺濃度

為[S]， 以1/V對(duì)1/[S]作圖， 得到洋金花提取物對(duì)MAO-B抑制作用的雙倒數(shù)曲線圖， 根據(jù)直線相交情況判定抑制作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2. 1 洋金花不同部位提取物對(duì)MAO-B的抑制作用 將底物芐胺濃度固定為其米氏常數(shù)Km， 考察洋金花不同部位提取物對(duì)MAO-B的抑制作用。洋金花花部位提取物對(duì)MAO-B的抑制作用最強(qiáng)， 為（55.74±1.5）%， 且提取物得率較高為17.40%；其次為果實(shí)、葉、莖、根， 而種子提取物對(duì)MAO-B的抑制作用最弱， 僅為（4.37±2.9）%。見表1。孫申田等[14]正是以洋金花花部位研成全粉， 取適量入膠囊對(duì)PD患者進(jìn)行治療。

2. 2 洋金花花提取物對(duì)MAO-B的量效抑制關(guān)系及IC50值

鑒于花的提取物對(duì)MAO-B的抑制作用最強(qiáng)， 因此， 選取花提取物作為抑制劑對(duì)MAO-B的量效抑制關(guān)系進(jìn)行考察， 分別選抑制劑取濃度為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml制備反應(yīng)體系， 以不加抑制劑的體系做對(duì)照， 固定各反應(yīng)體系中芐胺濃度為Km， 求得各濃度抑制劑對(duì)MAO-B的抑制率， 并計(jì)算其對(duì)MAO-B的半數(shù)抑制濃度IC50值。見圖1。隨著花提取物濃度的逐漸增加， MAO-B受到的抑制作用也越強(qiáng)。用GraphPad Prism 6對(duì)不同濃度下的抑制率數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， 得到當(dāng)?shù)孜锲S胺濃度為其米氏常數(shù)Km值時(shí)， 洋金花花部位提取物對(duì)MAO-B的半數(shù)抑制濃度IC50， 司來(lái)吉蘭為陽(yáng)性對(duì)照。見表2。

2. 3 洋金花花提取物對(duì)MAO-B的抑制機(jī)制考察 酶可逆性抑制劑的作用機(jī)理主要有4種， 即競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制及混合型抑制。對(duì)抑制類型的判斷主要是通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線法確定。競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用中， 雙倒數(shù)圖中各曲線與x軸交匯于一點(diǎn)；非競(jìng)爭(zhēng)作用中， 各曲線與y軸交匯于一點(diǎn)；反競(jìng)爭(zhēng)作用中， 各曲線平行；而混合型抑制作用中， 各曲線交匯于第二或第三象限。從洋金花花提取物對(duì)MAO-B抑制作用的雙倒數(shù)圖來(lái)看， 各曲線于第三象限交匯于一點(diǎn)， 屬于混合型抑制作用。見圖2。

3 小結(jié)

本文對(duì)洋金花治療PD的機(jī)理進(jìn)行了初步的探究。發(fā)現(xiàn)洋金花花提取物對(duì)MAO-B抑制效果最強(qiáng)， 抑制機(jī)制為混合型抑制， 表明提取物中含有MAO-B的可逆性抑制劑。MAO-B可逆性抑制劑在治療PD中具有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)， 如導(dǎo)致不良反應(yīng)的傾向較小等， 這可能是洋金花治療PD的機(jī)制之一。是否具有其他治療作用機(jī)制還有待進(jìn)一步考察。近年來(lái)從植物天然產(chǎn)物中尋找MAO-B抑制劑的研究越來(lái)越多， 目前已發(fā)現(xiàn)的MAO-B抑制劑包括生物堿、香豆素、黃酮、蒽醌類化合物等[19]。洋金花醇提水沉提取物中的有效成分還需進(jìn)一步研究。

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[收稿日期：2017-10-10]endprint