劉慧麗 薛艷鋒* 郝力壯** 劉書(shū)杰** 柴沙駝 張曉衛(wèi)
(1.省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海省高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810016;2.青海高原牦牛研究中心,西寧 810016;3.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,西寧 810016)
牦牛作為高原的特有物種,在嚴(yán)酷的自然環(huán)境下具有高免疫性、抗逆性和快速適應(yīng)性等特點(diǎn)[1],其絨、乳、肉等為牧民提供了主要的物質(zhì)生活資料。一直以來(lái),牦牛的生存主要依靠于天然草場(chǎng),低產(chǎn)犢率、低生長(zhǎng)速率、冷季掉膘嚴(yán)重等問(wèn)題嚴(yán)重制約著牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此近些年來(lái),牦牛的冷季補(bǔ)飼越來(lái)越受到研究者和牧民的關(guān)注,科學(xué)配制牦牛飼糧也顯得尤為重要。關(guān)于牦牛能量和蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)方面已經(jīng)有一定量的研究[2-3],但是關(guān)于牦牛微量元素錳方面的研究基本上處于空白狀態(tài)。錳作為微量元素的一種,是動(dòng)物生命活動(dòng)中所必需的微量元素之一。錳能促進(jìn)骨骼發(fā)育[4-5],參與造血[6],增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能[7-8],是很多酶類的組成成分[9]。郗麗蘭[10]報(bào)道,牛對(duì)飼糧錳的需要量為46.40~48.40 mg/kg。莊懷飛等[11]研究了不同飼糧錳、銅含量下荷斯坦公??寡趸笜?biāo)的變化,結(jié)果表明飼糧錳的適宜含量為50.00 mg/kg。紀(jì)守坤等[12]的研究表明,公羔羊和母羔羊?qū)﹀i的維持需要量分別為0.29和0.22 g/d,折算成每千克飼糧干物質(zhì)大約分別為116和88 mg/kg。本研究通過(guò)體外瘤胃發(fā)酵技術(shù)探究35~70 mg/kg的甘氨酸錳對(duì)生長(zhǎng)期牦牛瘤胃發(fā)酵的影響,旨在得出生長(zhǎng)期牦牛飼糧中錳微量元素的適宜含量,進(jìn)而完善牦牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn),為科學(xué)地配制牦牛補(bǔ)飼飼糧提供理論依據(jù),促進(jìn)牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
選擇3頭健康、體況接近、裝有永久性瘤胃瘺管的大通閹牦牛作為試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)飼糧包括精料和粗料(燕麥青干草),精粗比60∶40,單頭飼喂,每日2次(08:00、18:00),自由飲水。預(yù)飼15 d之后,清晨空腹采集瘤胃液。
參考我國(guó)《肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 815—2004)和文獻(xiàn)[13],按照150 kg牦牛日增重500 g設(shè)計(jì)牦?;A(chǔ)飼糧,以燕麥青干草作為粗料,精粗比為60∶40,以此飼糧為發(fā)酵底物,發(fā)酵底物組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。
表1 發(fā)酵底物組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))
采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì),共5個(gè)處理,每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。以甘氨酸錳(由長(zhǎng)沙興嘉生物工程有限公司提供,純度為21%,產(chǎn)品編號(hào)2015071810)形式在發(fā)酵底物中添加錳,使錳含量分別達(dá)到35.00、40.00、50.00、60.00、70.00 mg/kg(干物質(zhì)基礎(chǔ)),其他微量元素鐵、鋅、硒、銅的含量一致,分別為5.26、6.27、0.04、4.40 mg/kg(干物質(zhì)基礎(chǔ))。
按照Menke等[14]的方法制備人工瘤胃液,按照表2中各溶液的配方分別配制微量元素溶液(A液),緩沖液(B液),常量元素溶液(C液),指示劑和還原液。按照順序依次向2 L的玻璃廣口瓶中加入667 mL的超純水,0.17 mL的A液,333 mL的B液,333 mL的C液,1.70 mL的指示劑,67 mL的還原液,配制人工瘤胃液。30 mL人工瘤胃液和200 mg發(fā)酵底物共同裝入發(fā)酵管中,放入人工瘤胃培養(yǎng)箱,(39±0.5) ℃開(kāi)始發(fā)酵[15-16],分別在培養(yǎng)2、4、6、8、12、14、16、24、30、36、48 h讀取每個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)管的刻度并記錄。
表2 人工瘤胃液各單一溶液的配方
1.5.1 錳含量的測(cè)定
錳含量參考GB/T 13885—2003[17]測(cè)定,使用TAS-990原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵底物中微量元素錳含量。錳含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為:
Abs=0.182 90Conc.+0.003 140 0
(r=0.999 7,n=4)。
式中:Conc.為錳含量(μg/mL);Abs為279.5 nm處的吸光度值。
1.5.2 產(chǎn)氣量、pH、干物質(zhì)消失率(DMD)及微生物蛋白質(zhì)(MCP)和氨態(tài)氮(NH3-N)含量的測(cè)定
發(fā)酵底物產(chǎn)氣量和DMD采用以下公式計(jì)算:
產(chǎn)氣量(mL)=某時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)管
產(chǎn)氣量(mL)-對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)
空白管產(chǎn)氣量(mL);DMD(%)=[(樣本DM重-殘?jiān)麯M重+
空白管DM重)/樣本DM重]×100。
發(fā)酵液pH的測(cè)定使用HANNA-HI221高精密酸度計(jì)進(jìn)行。發(fā)酵液MCP含量用南京建成生物研究所提供的試劑盒測(cè)定。發(fā)酵液NH3-N含量采用馮宗慈等[18]改進(jìn)的比色法測(cè)定。
1.5.3 甲烷產(chǎn)量、VFA含量的測(cè)定
甲烷產(chǎn)量參考文獻(xiàn)[19-20]測(cè)定,使用氣相色譜儀(GC-2014,日本島津公司)測(cè)定體外瘤胃發(fā)酵所產(chǎn)生的氣體中的甲烷含量,進(jìn)而計(jì)算甲烷產(chǎn)量。測(cè)定條件:火焰氫離子檢測(cè)器(FID),色譜柱為毛細(xì)管柱(FFAP,30.00 m×0.32 mm,0.50 μm);色譜柱溫度為100 ℃,恒溫模式;汽化室溫度100 ℃;FID溫度110 ℃;進(jìn)樣量100 μL;載氣為高純氮?dú)?99.99%),壓力0.7 MPa;氫氣壓力0.4 MPa,空氣壓力0.4 MPa;毛細(xì)管柱壓力65 kPa,分流比40∶1。
本試驗(yàn)所使用的甲烷標(biāo)準(zhǔn)氣體委托蘭州華特化工供應(yīng)站生產(chǎn),氣體成分如表3所示。
表3 甲烷標(biāo)準(zhǔn)氣體成分
本試驗(yàn)所擬合的甲烷標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=249 833X+78 225.5(r=0.999)[Y為進(jìn)樣的峰面積,X為甲烷含量(mmol/L)]。
VFA含量參考文獻(xiàn)[21-22]測(cè)定。樣品的前處理:發(fā)酵液經(jīng)4層紗布過(guò)濾后,取5 mL于干凈的離心管中,3 000 r/min離心10 min,取上清液2 mL于離心管中,準(zhǔn)確加入0.2 mL、25%的偏磷酸溶液,混勻之后,靜置10 min充分反應(yīng),之后在12 000 r/min、4 ℃的條件下離心10 min,轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中,-80 ℃凍存,備用。
用氣相色譜儀測(cè)定VFA含量。測(cè)定條件:FID,色譜柱為毛細(xì)管柱(FFAP,30.00 m×0.32 mm,0.50 μm);色譜柱升溫程序,初始60 ℃,以10 ℃/min升溫至120 ℃,保留2 min,以15 ℃/min升溫至180 ℃,保留5 min;汽化室溫度250 ℃;FID溫度250 ℃;進(jìn)樣量1 μL,載氣為高純氮?dú)?99.99%),壓力0.7 MPa;氫氣壓力0.4 MPa,空氣壓力0.4 MPa,毛細(xì)管柱壓力0.6~0.8 MPa,分流比40∶1。本試驗(yàn)所擬合的VFA含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表4。
1.5.4 淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)、胰蛋白酶(TYS)和纖維素酶(CLS)活力的測(cè)定
AMS、LPS、TYS和CLS活力測(cè)定用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。單位定義:每毫升含酶溶液在37 ℃下與底物作用30 min,水解10 mg淀粉定義為1個(gè)AMS活力單位;每毫升含酶溶液在37 ℃下與底物反應(yīng)1 min,每消耗1 μmol底物定義為1個(gè)LPS活力單位;每毫升含酶溶液在pH 8.0、37 ℃的條件下,每分鐘使反應(yīng)體系的吸光度值變化0.003定義為1個(gè)TYS活力單位;每毫升含酶溶液每分鐘催化產(chǎn)生1 μg葡萄糖定義為1個(gè)CLS活力單位。
表4 VFA含量標(biāo)準(zhǔn)曲線
Y為進(jìn)樣的峰面積,X為組分含量(mmol/L)。
Ywas peak area of sample, andXwas component content (mmol/L).
采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)的初步整理,采用SAS 9.1.3軟件中ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析,采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
從表5中可以看出,隨著錳含量的升高,產(chǎn)氣量呈現(xiàn)降低趨勢(shì),發(fā)酵液pH呈現(xiàn)升高趨勢(shì),DMD呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。產(chǎn)氣量在錳含量為35.00 mg/kg時(shí)處于最高值73.80 mL,在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)處于次高值72.80 mL,錳含量為35.00、40.00、50.00和60.00 mg/kg時(shí)產(chǎn)氣量差異
不顯著(P>0.05),但這4個(gè)處理均顯著高于錳含量為70.00 mg/kg時(shí)(P<0.05)。甲烷產(chǎn)量在錳含量為60.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值8.01 mL,顯著高于錳含量為35.00、40.00和50.00 mg/kg時(shí)(P<0.05),但與錳含量為70.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)。DMD在錳含量為60.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值68.73%,顯著高于錳含量為35.00和70.00 mg/kg時(shí)(P<0.05),但與錳含量為40.00和50.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵液pH在錳含量為70.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值7.49(P<0.05),顯著高于錳含量為35.00和40.00 mg/kg時(shí)(P<0.05),但與錳含量為50.00和60.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)。
表5 發(fā)酵底物錳含量對(duì)體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量、甲烷產(chǎn)量、DMD及發(fā)酵液pH的影響
同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),相同或無(wú)小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。
In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same small or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.
從表6中可以看出,隨著錳含量的升高,發(fā)酵液NH3-N和MCP含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。發(fā)酵液NH3-N含量在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值10.60 mg/dL,顯著高于錳含量為50.00、60.00和70.00 mg/kg時(shí)(P<0.05),但與錳含量為35.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵液MCP含量在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值3.90 g/L,顯著高于錳含量為35.00、60.00和70.00 mg/kg時(shí)(P<0.05),但與錳含量為50.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)。
表6 發(fā)酵底物錳含量對(duì)體外瘤胃發(fā)酵發(fā)酵液NH3-N和MCP含量的影響
從表7中可以看出,隨著錳含量的升高,發(fā)酵液AMS、LPS、TYS活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),發(fā)酵液CLS活力呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。發(fā)酵液AMS活力在錳含量為60.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值0.51 U/mL,顯著高于錳含量為35.00、40.00和50.00 mg/kg時(shí)(P<0.05),但與錳含量為70.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05);發(fā)酵液LPS活力在錳含量為50.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值0.50 U/mL,顯著高于其他處理(P<0.05),錳含量
為40.00、60.00和70.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05),但顯著高于錳含量為35.00 mg/kg時(shí)(P<0.05);發(fā)酵液TYS活力在錳含量60.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值65.46 U/mL,顯著高于錳含量為35.00 mg/kg、70.00 mg/kg時(shí)(P<0.05),但與錳含量為40.00 mg/kg、50.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵液CLS活力各處理間差異不顯著(P>0.05),在錳含量為70.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值81.12 U/mL。
從表8中可以看出,隨著錳含量的升高,發(fā)酵液乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、總揮發(fā)性脂肪酸的含量都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。發(fā)酵液乙酸含量在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值47.12 mmol/L,顯著高于錳含量為50.00、60.00和70.00 mg/kg時(shí)(P<0.05),但與錳含量為35.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05);發(fā)酵液丙酸含量各處理間差異不顯著(P>0.05),在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值19.45 mmol/L;發(fā)酵液異丁酸含量各處理間差異不顯著(P>0.05),在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值0.35 mmol/L;發(fā)酵液丁酸含量各處理間差異不顯著(P>0.05),在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值5.41 mmol/L;發(fā)酵液異戊酸含量各處理間差異不顯著(P>0.05),在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值0.96 mmol/L;發(fā)酵液戊酸含量各處理間差異不顯著(P>0.05),在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值0.50 mmol/L;發(fā)酵液總揮發(fā)性脂肪酸含量在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值72.24 mmol/L,顯著高于錳含量為60.00和70.00 mg/kg時(shí)(P<0.05),但與錳含量為35.00和50.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05);發(fā)酵液乙酸/丙酸在錳含量為50.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最小值2.05,顯著低于錳含量為35.00、40.00和60.00 mg/kg時(shí)(P<0.05),但與錳含量為70.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)。
表8 發(fā)酵底物錳含量對(duì)體外瘤胃發(fā)酵發(fā)酵液VFA含量的影響
瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的多少反映飼糧的降解程度[23],產(chǎn)氣量越高,表明飼糧發(fā)酵越充分,為機(jī)體提供的能量越多,越有利于動(dòng)物的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中產(chǎn)氣量在錳含量為35.00 mg/kg時(shí)處于最高值,隨著錳含量的增加,產(chǎn)氣量逐漸降低,說(shuō)明錳含量越高,越不利于瘤胃發(fā)酵。甲烷產(chǎn)量在錳含量為60.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最高值。產(chǎn)氣量降低,甲烷產(chǎn)量反而升高,意味著能量損失增大。在錳含量為60.00 mg/kg時(shí),甲烷產(chǎn)量達(dá)到最高,為8.01 mL,高效酸丙酸的含量達(dá)到最低,為12.71 mmol/L,乙酸/丙酸達(dá)到最大,為2.87,表明錳含量為60.00 mg/kg時(shí)不利于動(dòng)物生長(zhǎng)。從發(fā)酵液MCP含量結(jié)果來(lái)看,也恰恰證明了這一點(diǎn),在錳含量為60.00 mg/kg時(shí),發(fā)酵液MCP含量較低,此時(shí)瘤胃微生物活力低。pH是瘤胃發(fā)酵的綜合反映,受發(fā)酵底物類型、有機(jī)酸沉淀等各種因素的影響[24],只有當(dāng)pH處于正常范圍之內(nèi),才能夠保證瘤胃發(fā)酵、飼料降解的正常進(jìn)行。本試驗(yàn)不同錳含量下體外瘤胃發(fā)酵后的發(fā)酵液pH在7.03~7.49,屬正常范圍(5.60~7.50)。
DMD直接反映飼糧在瘤胃中的降解程度。本試驗(yàn)中,DMD隨錳含量的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在錳含量為60.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值68.73%。由此可見(jiàn),錳含量為60.00 mg/kg時(shí)最有利于飼料的降解。錳可以顯著促進(jìn)瘤胃微生物對(duì)纖維素的降解。Martinez等[25]研究表明,底物中錳含量為5.00~30.00 mg/L時(shí),都能促進(jìn)瘤胃微生物降解纖維素,而其中錳含量為15.00 mg/L時(shí)效果最佳。黃靜龍[26]研究表明,40.00 mg/kg錳組的飼糧表觀消化率顯著高于120.00 mg/kg錳組和160.00 mg/kg錳組。DMD的結(jié)果與瘤胃消化道酶活力的測(cè)定結(jié)果基本吻合,發(fā)酵液AMS、LPS、TYS活力隨錳含量的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),只有發(fā)酵液CLS活力隨錳含量的升高呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢(shì),并且都在錳含量為40.00~60.00 mg/kg時(shí)處于較高水平。因此從瘤胃消化酶活力和DMD的角度看,當(dāng)錳的含量在40.00~60.00 mg/kg時(shí),最有利于飼糧的降解。
NH3-N來(lái)源于飼糧中蛋白質(zhì)的降解,主要用于微生物合成MCP[27],在瘤胃中基本處于動(dòng)態(tài)平衡。本試驗(yàn)中的發(fā)酵液NH3-N含量在6.42~10.60 mg/dL,都處于正常范圍(0.35~29.00 mg/dL[28-29])。發(fā)酵液NH3-N含量隨著錳含量的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),并且在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最高值。MCP提供了反芻動(dòng)物機(jī)體40%~60%的蛋白質(zhì)需要量。發(fā)酵液MCP含量隨著錳含量的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),且在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值。由此可見(jiàn),錳含量為40.00 mg/kg時(shí),最有利于NH3-N和MCP的形成。
VFA是反芻動(dòng)物重要的能量物質(zhì),提供了反芻動(dòng)物60%~80%的消化能[30-31]。乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、總揮發(fā)性脂肪酸的含量都隨著錳含量的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),都在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最高值,并且都在錳含量為35.00~50.00 mg/kg時(shí)處于較高水平。同時(shí),對(duì)于反芻動(dòng)物來(lái)說(shuō),為機(jī)體提供能量的物質(zhì)主要是來(lái)源于肝臟組織中糖異生作用產(chǎn)生的葡萄糖,而丙酸是糖異生作用的重要前體物質(zhì),是一種高效酸,乙酸/丙酸越低,表明丙酸所占比例也越大,越利于反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中乙酸/丙酸在錳含量為50.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最低值2.05,最有利于瘤胃發(fā)酵過(guò)程中高效酸丙酸的生成。因此,從揮發(fā)性脂肪酸的角度看,當(dāng)錳含量為35.00~50.00 mg/kg時(shí),有利于瘤胃發(fā)酵能量物質(zhì)的生成。
① 對(duì)于生長(zhǎng)期牦牛,若以甘氨酸錳作為錳元素添加形式,推薦牦牛飼糧錳含量在40.00~50.00 mg/kg,有利于瘤胃發(fā)酵和飼草料降解。
② 根據(jù)現(xiàn)有資料設(shè)定的牦牛飼糧中錳含量只有33.82 mg/kg,遠(yuǎn)低于牦牛對(duì)錳的需要量40.00~50.00 mg/kg,處于極度缺乏狀態(tài),必須額外補(bǔ)充微量元素錳,才能改善牦牛瘤胃發(fā)酵,提高生長(zhǎng)性能。
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*Contributed equally
**Corresponding authors: HAO Lizhuang, associate professor, E-mail: lizhuanghao1122@foxmail.com; LIU Shujie, professor, E-mail: mkylshj@126.com
動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)2018年1期