高效液相色譜法測(cè)定共軛亞油酸甘油酯

劉珍珠，張輝珍，孫云飛，邱阿敏，梁小芳，王曉濱

共軛亞油酸甘油酯產(chǎn)品是以紅花籽油為原料，通過(guò)共軛化反應(yīng)將其中的亞油酸轉(zhuǎn)化成共軛亞油酸［1－2］，然后與甘油進(jìn)行酯化反應(yīng)，生成共軛亞油酸甘油酯［3－4］。衛(wèi)生部2009年第12號(hào)公告批準(zhǔn)其作為新資源食品，可以直接服用或者添加到脂肪、食用油和乳化脂肪制品中。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)共軛亞油酸甘油酯的研究大多集中在制備、萃取和合成方面［5］。而共軛亞油酸甘油酯的檢測(cè)方法一直是制約其生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品質(zhì)量的一個(gè)難題，目前國(guó)內(nèi)外沒(méi)有共軛亞油酸甘油酯的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)。脂肪酸甘油酯的測(cè)定方法有薄層層析法（TLC）［6－8］、氣相色譜法（GC）［9－11］、高溫氣相色譜（HTGC）直接進(jìn)樣法［9－10］和高效液相色譜法（HPLC）［12－14］。TLC 精度不高，GC 無(wú)法確定脂肪酸的酯型，HTGC的靈敏度低、重現(xiàn)性差。用HPLC測(cè)定時(shí)，由于脂肪酸甘油酯的紫外吸收是羧基的末端吸收，吸收強(qiáng)度很弱，紫外檢測(cè)器靈敏度低［15］；用示差折光檢測(cè)器（RID）檢測(cè)時(shí)，由于 RID對(duì)流動(dòng)相的穩(wěn)定性要求苛刻，無(wú)法用梯度洗脫，不適合用于極性差別大的甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯的檢測(cè)。有報(bào)道利用HPLC在233 n m處測(cè)定牛奶脂肪中共軛亞油酸甘油酯的含量［16－17］，但由于沒(méi)有商品化的共軛亞油酸甘油酯的標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)其定量只能用歸一化法，而不同共軛亞油酸酯型的紫外吸收強(qiáng)度有很大差別，歸一化法定量的結(jié)果誤差很大。文獻(xiàn)［18-19］報(bào)道了采用 HPLC-蒸法光散射檢測(cè)器（ELSD）測(cè)定了單脂、二酯和三脂化合物，但國(guó)內(nèi)對(duì)共軛亞油酸甘油酯的測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道。

本工作采用反相高效液相色譜梯度分離，ELSD檢測(cè)，通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相和檢測(cè)器參數(shù)，使共軛亞油酸甘油三酯、二酯和一酯得到很好的分離和測(cè)定。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀，配ELSD。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：10．00 g·L－1，分別稱取亞油酸甘油三酯、1，3-亞油酸甘油二酯、1，2-亞油酸甘油二酯和1-亞油酸甘油一酯對(duì)照品各0．100 0 g于10 mL容量瓶中，用正己烷-異丙醇（9＋1）溶液溶解并定容。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：移取亞油酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液3．00 mL、1，3-亞油酸甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0．40 mL、1，2-亞 油 酸 甘 油 二 酯 標(biāo) 準(zhǔn) 儲(chǔ) 備 溶 液0．30 mL、1-亞油酸甘油一酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0．10 mL于10 mL容量瓶中，用正己烷-異丙醇（9＋1）溶液稀釋并定容，此溶液中亞油酸甘油三酯、1，3-亞油酸甘油二酯、1，2-亞油酸甘油二酯、1-亞油酸甘油一酯的質(zhì)量濃度分別為3．00，0．40，0．30，0．10 g·L－1。

亞油酸三甘酯、1，3-亞油酸二甘酯、1，2-亞油酸二甘酯、1-亞油酸一甘酯對(duì)照品，純度不小于99．0%。

正己烷、異丙醇、乙酸乙酯、甲酸均為色譜純。

1．2 儀器工作條件

ZORBAX RX-SIL色譜柱（4．6 mm×150 mm，5μm）；流動(dòng)相A為正己烷，流動(dòng)相B為正己烷-異丙醇-乙酸乙酯-甲酸（80＋10＋10＋0．1）混合液；流量1 mL·min－1；進(jìn)樣量10μL。梯度洗脫程序：0～2 min時(shí)，A為98%；2～8 min時(shí)，A由98%降為65%；8～8．5 min時(shí)，A 由65%降為2%；8．5～15 min時(shí)，A保持為2%；15～15．1 min時(shí)，A 由2%升至98%；15．1～19 min時(shí)，A保持為98%。氮?dú)饬髁?．5 mL·min－1；漂移管溫度40℃。

1．3 試驗(yàn)方法

稱取樣品0．100 0 g置于100 mL容量瓶中，用正己烷-異丙醇（9＋1）溶液溶解并定容，充分混勻后，在儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜行為

在儀器工作條件下，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 色譜圖Fig．1 Chro matogra ms

2．2 流動(dòng)相的選擇

甘油酯的極性較弱，易溶于正己烷等非極性溶劑，在甲醇等極性溶劑中溶解度小，所以試驗(yàn)選用非極性的硅膠柱分離。甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯的極性相差較大，甘油三酯由于沒(méi)有暴露的羥基，所以極性最弱，在正相色譜分離中最先流出。甘油一酯有兩個(gè)未結(jié)合的羥基，所以有一定的極性，在正己烷中的溶解度低，流動(dòng)相中正己烷體積分?jǐn)?shù)高于95%時(shí)出峰時(shí)間很晚。在等度洗脫條件下，無(wú)法很好地分離樣品中存在的甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯。試驗(yàn)選用正己烷作為流動(dòng)相之一，通過(guò)梯度添加不同比例的異丙醇、乙酸乙酯、甲酸來(lái)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性，使甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯得到有效分離，梯度洗脫條件見(jiàn)1．2節(jié)。

2．3 檢測(cè)器參數(shù)的選擇

漂移管溫度和載氣流量是ELSD的兩個(gè)重要參數(shù)。漂移管的溫度會(huì)影響到霧化時(shí)溶質(zhì)顆粒的大小、均勻程度，進(jìn)而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。試驗(yàn)將漂移管的溫度分別設(shè)為70，60，50，40℃，結(jié)果表明，當(dāng)漂移管的溫度為40℃時(shí)，響應(yīng)值最大且噪聲較小、基線平穩(wěn)。載氣流量大小決定基線穩(wěn)定性和響應(yīng)值，在一定范圍內(nèi)，載氣流量越大，基線越平穩(wěn)但響應(yīng)值越小。試驗(yàn)從2．0 mL·min－1逐漸降低載氣流量，發(fā)現(xiàn)載氣流量為1．5 mL·min－1時(shí)，基線穩(wěn)定，信噪比最佳。

2．4 樣品溶劑的選擇

共軛亞油酸甘油三酯易溶于石油醚、正己烷等非極性有機(jī)溶劑，不溶于水和冰乙醇；共軛亞油酸甘油二酯比甘油三酯的極性大；甘油一酯有兩個(gè)游離的羥基，極性最大，在非極性的正己烷中溶解性不好，正己烷中添加少量的異丙醇會(huì)大大增加甘油一酯的溶解度。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在正己烷-異丙醇（9＋1）溶液，樣品的溶解性很好，溶液澄清透明。因此，試驗(yàn)選擇正己烷-異丙醇（9＋1）溶液為樣品溶劑。

2．5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50，100，150，200，300，400μL，用正己烷-異丙醇（9＋1）溶液定容至1 mL，進(jìn)樣分析，以各物質(zhì)的質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各物質(zhì)的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

按3倍信噪比計(jì)算檢出限，10倍信噪比計(jì)算測(cè)定下限，結(jié)果見(jiàn)表1。

2．6 樣品分析

按試驗(yàn)方法測(cè)定共軛亞油酸甘油酯中的亞油酸甘油三酯、1，3-亞油酸甘油二酯、1，2-亞油酸甘油二酯和1-亞油酸甘油一酯，平行測(cè)定6次，計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表2。

本工作建立了測(cè)定共軛亞油酸甘油酯中甘油三酯、甘油二脂、甘油一酯的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法。方法精密度高、靈敏度高，適合對(duì)共軛亞油酸甘油酯產(chǎn)品進(jìn)行快速分析，對(duì)共軛亞油酸甘油酯的生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量控制具有指導(dǎo)意義。

表1 線性參數(shù)和檢出限Tab．1 Linearity para meters and detection li mits

表2 樣品分析結(jié)果（n＝6）Tab．2 Analytical results of sample（n＝6）

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