鐵離子對厭氧氨氧化污泥富集培養(yǎng)的影響

毛念佳，嵇鴻民，許 柯，任洪強

（南京大學環(huán)境學院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室，江蘇南京 210023）

厭氧氨氧化即厭氧條件下厭氧氨氧化菌以氨氮為電子供體，亞硝酸鹽為電子受體，并將其轉(zhuǎn)化為氮氣的生物脫氮過程［1-2］。相較于傳統(tǒng)硝化反硝化工藝，厭氧氨氧化具有脫氮效能高、曝氣消耗小、無需外加有機碳源、剩余污泥產(chǎn)量少等優(yōu)勢［3-5］，發(fā)現(xiàn)之初便成為污水生物脫氮領(lǐng)域的研究熱點。

作為厭氧氨氧化功能承載者的厭氧氨氧化菌細胞產(chǎn)率低、生長速率緩慢，導致厭氧氨氧化污泥富集培養(yǎng)緩慢、工藝啟動時間長［6-8］。當前對厭氧氨氧化污泥富集培養(yǎng)的研究，主要集中于反應器構(gòu)型［9-10］、填料添加［11-12］、接種污泥［13］、參數(shù)優(yōu)化［14］等方面，而對微量元素的影響研究較少。鐵元素作為微生物生長必需的微量元素，對厭氧氨氧化菌的生理生化功能具有重要影響。Strous等［15］分析厭氧氨氧化菌Candidatus K.stuttgartiensis基因組發(fā)現(xiàn)其存在代謝Fe（Ⅲ）的電子傳遞途徑；此外，厭氧氨氧化菌富含鐵元素顆粒［16］，多種功能蛋白合成需要大量血紅素［17-19］，鐵元素作為血紅素的重要組分，無疑會對厭氧氨氧化污泥的富集培養(yǎng)產(chǎn)生影響，當前則較少有研究涉及。

本研究通過對照試驗考察了鐵離子對厭氧氨氧化污泥富集培養(yǎng)的影響，并采用熒光定量PCR及16S rRNA高通量測序技術(shù)從微生物生態(tài)學解析其機理，研究結(jié)果對厭氧氨氧化污泥的富集培養(yǎng)及工藝啟動具有參考價值和指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置與運行條件

試驗采用小試規(guī)模厭氧顆粒污泥膨脹床反應器（expanded granular sludge bed，EGSB），由有機玻璃制作，有效容積為0.8 L，外覆錫紙以隔絕光的影響［20］。反應器運行溫度通過恒溫循環(huán)水槽維持在35℃，進水 pH 值用 0.1 mmol／L 鹽酸調(diào)節(jié)為 6.6～6.8，以保證 Fe（Ⅲ）的溶解；本試驗采用連續(xù)流，水力停留時間（HRT）為24 h，試驗裝置如圖1所示。

圖1 試驗裝置示意圖Fig.1 Schematic Diagram of Experimental Device

1.2 接種污泥與模擬廢水

試驗所用接種污泥取自南京某市政污水廠氧化溝缺氧段，為棕黃色絮狀污泥。反應器接種污泥量為20 g／L，接種前用pH值＝7.2的磷酸鹽緩沖液沖洗三次，以洗去殘余物質(zhì)。模擬廢水以自來水配置，組分為：（NH4）2SO4（按需配制）、NaNO2（按需配制）、KH2PO410 mg ／L、CaCl2·2H2O 5.6 mg ／L、MgSO4·7H2O 300 mg ／L、KHCO3500 mg ／L、EDTA 25 mg／L、微量元素濃縮液Ⅰ 1.25 mL ／L、微量元素濃縮液Ⅱ（按需配制）。微量元素濃縮液Ⅰ組分為：FeSO40.625 mL ／L、H3BO40.0175 mL ／L、MnCl2·4H2O 1.2375 mL ／L、CuSO4·5H2O 0.3125 mL ／L、ZnSO4·7H2O 0.5375 mL ／L、NiCl2· 6H2O 0.2375 mL ／L、NaSeO4· 10H2O 0.262 5 mL ／L、NaMoO4· 2H2O 0.275 mL／L。微量元素濃縮液Ⅱ：FeCl3（按需配制），R1為控制組，模擬廢水中不添加微量元素濃度液Ⅱ；而試驗組R2、R3中添加微量元素濃縮液Ⅱ并控制 Fe（Ⅲ）濃度分別為 0.04、0.08 mmol／L。模擬廢水預曝高純氮氣（＞99.5%）至溶解氧濃度（DO）低于 0.5 mg／L，再泵入反應器中。

1.3 常規(guī)指標分析方法

反應器出水定期采樣，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后測定，分析測定方法參考國家標準［21］。采用水楊酸分光光度法；采用 N－（1-萘基）－乙二胺分光光度法；用酚二磺酸分光光度法；Fe（Ⅲ）采用鄰菲啰啉光光度法；溶解氧（DO）以便攜式溶解氧儀測定，pH值由 pH計測定。

1.4 污泥粒徑分析

從反應器中取一定量污泥至50 mL離心管中，置于激光粒度儀（Mastersizer 3000，英國馬爾文儀器有限公司）中檢測。樣品充分混勻后，以水為分散劑進行分析測試，并使用機器配置的軟件進行記錄，使用一次性塑料滴灌吸取攪拌均勻的樣品，污泥樣加至遮光度在10%～15%時進行測試。單一樣品重復測定3次，以降低誤差。

1.5 實時熒光定量PCR分析

污泥樣品采用FastDNA SPIN Kit for soil試劑盒提取污泥DNA，而后用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計定量，采用SYBR?Green染料法進行定量PCR分析。選取目標基因包括：細菌16S rRNA基因、厭氧氨氧化菌16S rRNA基因及部分氮素轉(zhuǎn)化功能基因，以含有目標基因的質(zhì)粒標準品建立標準曲線（R2＞0.999）。擴增體系為 25 μL，含 12.5 μL 2×SYBR?Green PCR Master Mix（Vazyme，中國），2 μL 模板 DNA（20 ng／μL），正反引物各 0.2 μL，10.1 μL無菌超純水；擴增程序在熒光定量PCR儀AB7500（Life Technologies，美國）進行，每個樣品做三個平行，具體參數(shù)如表1所示。

表1 目標基因的引物序列及退火溫度Tab.1 Primers Sequence for Target Genes and Corresponding Annealing Temperature

1.6 16S rRNA高通量測序分析

16S rRNA高通量測序分析基于Illumina Miseq測序平臺，具體步驟包括DNA提取、PCR擴增、產(chǎn)物驗證及純化、測序及結(jié)果分析。DNA提取見1.5，PCR擴增采用細菌通用引物，引物序列為：正向引物（5’-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3’），反向引物（5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’）；擴增體系為 50 μL，含 5 μL 10×PCR Buffer （TaKaRa，日本）、0.25 μL Ex Taq DNA 聚 合 酶、4 μL MgCl2、4 μL DNTP Mixture、2 μL DNA 模板（20 ng ／μL）、正反引物各 1 μL，無菌超純水若干。擴增反應于 Veriti PCR儀（Life Technologies，美國）進行，擴增程序為：預變性 98℃／5 min，擴增循環(huán) 20次（變性 98℃／30 s，退火 50 ℃ ／30 s，延伸 72 ℃ ／40 s），延伸 72 ℃ ／10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，經(jīng)E.Z.N.A.TMCycle-Pure Kit試劑盒純化后，送至江蘇中宜金大分析檢測有限公司進行測序分析。測序數(shù)據(jù)使用Sickle和Mothur程序降噪處理，而后用RDP classifier對序列分類，使用 Heml程序繪制熱圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應器運行性能

厭氧氨氧化污泥富集培養(yǎng)過程中，為考察鐵離子的影響，反應器保持同步容積氮負荷提升，直至運行穩(wěn)定。反應器R1、R2、R3進出水氮素指標、容積氮負荷及氮去除速率如圖2所示。

圖2 鐵離子對厭氧氨氧化污泥富集培養(yǎng)過程中脫氮效能的影響（a）、（c）、（e）氮素指標；（b）、（d）、（f）容積氮負荷及氮去除速率Fig.2 Influence of Fe（Ⅲ）on Denitrification Performance during Enrichment Cultivation Process（a）、（c）、（e）Nitrogen Profile；（b）、（d）、（f）Nitrogen Load Rate （NLR）and Nitrogen Removal Rate （NRR）

由圖2可知，富集培養(yǎng)初期（0～4 d）各反應器均出現(xiàn)菌體自溶現(xiàn)象，表現(xiàn)為出水濃度高于進水。由于進水中無有機碳源，且溶解氧濃度嚴格限制，導致部分微生物難以適應無機環(huán)境而自溶［29］。在菌體自溶階段，反應器中存在強烈的內(nèi)源反硝化作用，出水及濃度幾乎為0；此時反應器污泥顏色由黃棕變黑，并伴有明顯的減量。

隨著菌體自溶作用的減弱，反應器進入活性遲滯階段，表現(xiàn)出微弱的厭氧氨氧化作用。在此階段（5～38 d），進水和保 持在45.1 mg／L和 61.1 mg／L，各反應器運行并未表現(xiàn)出明顯差異。各反應器中出水濃度為 24.6～42.6 mg／L，平均去除率為 21.8%～26.7%，反應器出水濃度較低，表明反應器中仍存在一定的反硝化作用。在此階段，各反應器逐漸適應環(huán)境，反硝化作用減弱，出水水質(zhì)變化特征類似。

隨著反硝化功能的減弱，各反應器中厭氧氨氧化作用不斷增強，成為主要脫氮途徑，為活性提高階段。在此過程，各反應器進水容積氮負荷同步提升，由于鐵離子的添加，反應器表現(xiàn)出不同的容積氮負荷耐受能力。反應器R1活性提高階段為39～88 d，容積氮負荷由 132.6 mg ／（L·d）提升至 489.4 mg ／（L·d）；R2在活性提高階段（39～100 d）容積氮負荷由 132.6 mg／（L·d）提升至 580.9 mg ／（L·d）；R3活性提高階段為 39～112 d，容積氮負荷由132.6 mg／（L·d）提升至 696.6 mg ／（L·d）。容積氮負荷提升量由高到低為R3＞R2＞R1；此外，活性提高階段 R1、R2、R3中平均總氮去除率分別為82.9%、84.2%、85.3%，試驗組 R2、R3 整體脫氮效率略高于R1。

在厭氧氨氧化污泥富集培養(yǎng)中，由于厭氧氨氧化菌生長緩慢，反應器容積負荷有限。許多研究證明了高氮素基質(zhì)對厭氧氨氧化菌的抑制作用［30-33］。Strous等［7］研究表明亞硝酸鹽濃度達到 100 mg／L，即可強烈抑制厭氧氨氧化菌活性；本研究以出水亞硝酸鹽濃度高于100 mg／L作為反應器超過可承受負荷并失穩(wěn)的依據(jù)。對照組R1在運行90 d時，容積氮負荷超出反應器承受極限，出水和濃度急劇升高，類似失穩(wěn)現(xiàn)象也出現(xiàn)在試驗組 R2（第 102 d）、R3（第 114 d）。反應器失穩(wěn)后，降低進水基質(zhì)氮濃度，同時加大回流比以解除基質(zhì)自抑制；由于EGSB反應器抗沖擊負荷能力強，反應器很快恢復穩(wěn)定運行。穩(wěn)定階段反應器運行狀況如表2 所示。Chen 等［34］通過批次試驗證明了3.68 mg ／L的鐵離子添加下，比厭氧氨氧化活性可提高533.2%；長期試驗證明，鐵離子的添加，相較于控制組，提升了19.5%的反應器容積負荷，與本研究結(jié)果類似。

表2 穩(wěn)定階段反應器運行狀況Tab.2 Operation Status of Reactors at Stabilization Stage

2.2 污泥粒徑分布

本研究采用EGSB反應器培養(yǎng)厭氧氨氧化污泥，接種污泥為絮狀反硝化污泥，取接種污泥及130 d污泥樣品，用激光粒度儀分析其粒徑，結(jié)果如圖3所示。

圖3 污泥粒徑分布Fig.3 Particle Size Distribution of Sludge Samples

富集培養(yǎng)130 d時，表觀觀察發(fā)現(xiàn)污泥呈顆?；卣?。激光粒度分析結(jié)果顯示，反應器R1、R2、R3中污泥樣品平均粒徑分別為 796、908 μm和1 040 μm，試驗組 R2、R3 中污泥粒徑較高。據(jù)DLVO理論，當負載電性相同的電荷時，由于細菌個體之間靜電斥力的存在，不利于顆粒狀富集培養(yǎng)物的形成。添加多價陽離子（Ca2＋、Mg2＋、Fe3＋、Al3＋等），可以減少細菌間的靜電斥力，通過壓縮雙電層促進細胞聚集，進而強化顆粒污泥富集［35］。本試驗中，鐵離子的添加強化了厭氧氨氧化污泥的顆粒化；除減少細菌間靜電斥力作用外，鐵離子還是酶的常見活性劑，提高微生物代謝活性，促進微生物生長，加速厭氧氨氧化污泥的顆粒化［36］。

2.3 功能基因及厭氧氨氧化菌豐度變化

定量PCR結(jié)果顯示（圖4），經(jīng)過130 d的富集培養(yǎng)，各反應器微生物的量明顯提升，細菌16S rRNA 拷貝數(shù)由初始的 1.04×107copies／ng DNA 分別提高到 1.34×107copies／ng DNA （對照組 R1）、2.73×107copies／ng DNA（試驗組 R2）和 3.63×107copies／ng DNA （試驗組 R3）；R2、R3 中豐度顯著高于R1（p＜0.05）。由于進水中不含有機碳源，且嚴格限氧，反硝化微生物受到抑制，相關(guān)的功能基因napA（編碼周質(zhì)硝酸鹽還原酶）、narG（編碼膜結(jié)合硝酸鹽還原酶）、nirK（編碼銅型亞硝酸還原酶）、nirS（編碼細胞色素cd1型亞硝酸還原酶）的豐度顯著降低。接種污泥中基因narG、napA、nirS、nirK豐度分別為 1.01×106、3.16×105、4.71×106、1.01×107copies／ng DNA，經(jīng)過130 d的富集培養(yǎng)，其在反應器中豐度分別降至 6.86×103～8.65×103、1.96×104～4.24×104、1.47×104～6.01×104、2.70×104～5.35×104copies／ng DNA，反應器 R1、R2、R3 間無顯著差異。此外，接種污泥中氨單加氧酶編碼基因amoA豐度為 5.05×103copies／ng DNA，富集培養(yǎng) 130 d后，反應器中 amoA基因拷貝數(shù)為 2.49～2.90×102copies／ng DNA。

隨著污泥的富集培養(yǎng)，厭氧氨氧化成為反應器主要的脫氮途徑，相應的，厭氧氨氧化菌16S rRNA和功能基因hzsB豐度顯著增加。富集培養(yǎng)130 d后，R2、R3中Anammox 16S rRNA 豐度分別為6.96×106、8.47×106copies／ng DNA，顯著高于對照組 R1中豐度（p＜0.05）。

聯(lián)氨合成酶為厭氧氨氧化菌的重要功能蛋白［37］，其編碼基因hzsB豐度經(jīng)富集培養(yǎng)過程也明顯提高；130 d時，對照組R1中hzsB豐度為6.83×106copies／ng DNA，而試驗組 R2、R3 中其豐度分別為 9.86×106、1.24×107copies／ng DNA，顯著高于對照組 R1（p＜0.05）?？梢酝茰y，鐵離子對厭氧氨氧化菌富集具有一定促進作用，同時提高了厭氧氨氧化活性，也與反應器脫氮效能結(jié)果一致。

圖4 鐵離子對細菌、厭氧氨氧化菌及氮素轉(zhuǎn)化功能基因豐度的影響Fig.4 Influence of Fe（Ⅲ）on Abundance of Bacterial 16S rRNA，Anammox 16S rRNA and Functional Genes Related to Nitrogen Transformation

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)變化

接種污泥及富集培養(yǎng)130 d后，各反應器污泥微生物群落結(jié)構(gòu)如圖5所示。接種污泥為反硝化污泥，由圖5（a）可見變形菌（Proteobacteria）和綠彎菌（Chloroflexi）為其優(yōu)勢菌門，分別占比 44.08%和19.11%；富集培養(yǎng)過程中微生物菌群結(jié)構(gòu)顯著改變，Proteobacteria菌豐度分別降至 31.72% （R1）、30.74% （R2）、30.52% （R3）。綠彎菌（Chloroflexi）相對豐度無明顯變化，而厭氧氨氧化菌所屬浮霉菌（Planctomycetes）豐度明顯提高，由接種污泥中的0.20%提高至 5.10% （R1）、7.31% （R2）、9.54%（R3），試驗組中富集程度較高。

圖5 污泥微生物群落結(jié)構(gòu)分布（a）門水平；（b）屬水平（相對豐度＞0.1%）Fig.5 Distribution of Dominant Bacteria in Sludge Samples（a）Phylum Level；（b）Genus Level（Relative Abundance＞0.1%）

圖5（b）為污泥微生物屬水平熱圖。由圖5可知，厭氧氨氧化菌Candidate Brocadia明顯富集；接種污泥中Candidate Brocadia菌難以檢測其豐度（＜0.01%），經(jīng)130 d的富集培養(yǎng)，對照組R1污泥樣品中厭氧氨氧化菌Candidate Brocadia相對豐度為4.2%，而試驗組R2、R3污泥樣品中其豐度分別為6.8%、8.2%，高于對照組 R1。

3 結(jié)論

（1）進水添加鐵離子富集培養(yǎng)厭氧氨氧化污泥過程中，試驗組R2、R3與對照組R1中呈現(xiàn)類似的規(guī)律性，而試驗組可承受容積氮負荷顯著高于對照組。穩(wěn)定階段，試驗組R2、R3容積氮去除速率分別為 495.6、602.4 mg－N／（L·d），為對照組 R1 的1.20和1.46倍。進水添加鐵離子提高了反應器容積氮負荷及運行效能。

（2）進水添加鐵離子富集培養(yǎng)厭氧氨氧化污泥130 d后，污泥群落結(jié)構(gòu)及功能基因豐度顯著變化。反硝化功能基因narG、napA、nirS、nirK豐度顯著降低，厭氧氨氧化菌及微生物量富集明顯。試驗組R2、R3中厭氧氨氧化菌Candidate Brocadia相對豐度為6.8%、8.2%，明顯高于對照組 R1（4.2%）。

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