右美托咪定聯(lián)合烏司他丁對大鼠呼吸機相關性肺損傷的保護作用及機制

陶廣華，劉向六，羅 偉，劉芳芳，李利華，高倫明，張培茂，朱月浩，劉文值

(1. 攀枝花學院附屬醫(yī)院，四川 攀枝花 617000；2. 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，江蘇 南京 210002)

呼吸機相關性肺損傷(VILI)是因患者肺部或全身性疾病所致機體氧合功能障礙或低氧血癥而采取長時間的機械通氣導致的不可逆性肺部損害，其是引起患者急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的最常見原因之一[1]。目前研究證實，VILI的發(fā)生可能與機械通氣選擇的潮氣量、通氣時間、通氣模式等因素有關[2]，不恰當?shù)臋C械通氣策略常導致肺泡的剪切傷、容積傷及生物性損傷的發(fā)生，繼而引發(fā)肺泡結構及功能的改變，如肺泡/肺間質的水腫及通透性改變。肺泡不僅是參與氣體交換的最小肺單位，還是產生許多重要生物活性蛋白如肺表面活性蛋白Ⅱ的場所。VILI發(fā)生的本質是機械牽拉引起的肺泡及肺組織炎癥性病變，包括絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)、Toll樣受體(TLRs)、核轉錄因子NF-κB、炎癥小體NLRP3、自噬小體等蛋白及相關通路的激活等過程的參與[3-6]。因此，尋找有效的藥物或方法以減輕VILI所致的炎癥對該疾病的治療具有重要價值。本研究觀察了右美托咪定聯(lián)合烏司他丁對VILI模型大鼠肺損傷的保護效應，并探討了其作用機制，旨在為VILI的治療提供更多依據。

1 實驗資料

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠40只,體質量(250±20)g,購自攀枝花學院動物中心，動物合格證號：SYXK(川)：2014-0004。

1.2藥品、試劑及主要儀器 鹽酸右美托咪定注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：15040932)；注射用烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，批號：20140812)；白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)及磷酸化的核轉錄因子-κB(p-NF-κB)ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；兔抗大鼠GAPDH mAb、兔抗鼠NF-κB mAb、兔抗鼠SOD mAb均購自cell cytoskeleton公司;酶標二抗山羊抗兔IgG購自美國abnova公司；蘇木素染液購自碧云天。DNM-9606型酶標儀(普朗醫(yī)療)；德國Effendorf 5810R高速冷凍離心機；血氣分析儀(Stat Profile pHOx，美國Nova Biomedical公司)；DSX100型光學顯微鏡(OLYMPUS，日本)；Bio-Rad電泳儀(伯樂，美國)；kent TOPO大鼠呼吸機(贊德儀器有限公司，美國)。

1.3實驗方法 采用電腦數(shù)字法將40只SD大鼠隨機均分為生理鹽水組、烏司他丁組、右美托咪定組、右美托咪定+烏司他丁組，各組大鼠均參考文獻[7]方法建立VILI模型。將大鼠置于實驗室環(huán)境48 h后進行實驗，術前禁食6 h、禁飲2 h，然后以10%水合氯醛(4 mL/kg)經腹腔注射麻醉。常規(guī)行大鼠頸部備皮，仰臥位固定于超凈手術臺，以碘酊及75%乙醇消毒頸正中皮膚后做1cm大小的切口，鈍性分離至顯露氣管及右側頸總動脈，分別行頸動脈穿刺置管有創(chuàng)血壓監(jiān)測及氣管插管呼吸機持續(xù)機械通氣[吸入氧濃度為21%，吸呼比=1∶1，呼吸頻率(f)78次/min，潮氣量(VT)40 mL/kg，PEEP 0 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)]；開放右側股靜脈以5 mL/(kg·h)的速率輸注生理鹽水，監(jiān)測肛溫于36.9～38.1 ℃；據大鼠血壓、心率及機體反應適時追加10%水合氯醛0.1～0.3 mL維持麻醉深度。機械通氣開始即刻，分別于各組大鼠的右側股靜脈內給予相應干預：生理鹽水組以0.5 mL/(kg·h)的速度持續(xù)泵注生理鹽水2 mL；烏司他丁組持續(xù)泵注濃度為1 000 IU/mL的烏司他丁生理鹽水混合液2 mL，泵速0.5 mL/(kg·h)；右美托咪定組以1 μg/(kg·h)的速度持續(xù)泵注濃度為0.5 μg/mL的右美托咪定生理鹽水混合液2 mL；右美托咪定+烏司他丁組以1 μg/(kg·h)的速度持續(xù)泵注濃度為0.5 μg/mL的右美托咪定生理鹽水混合液1 mL及濃度為1 000 IU/mL的生理鹽水混合液1 mL。

1.4檢測指標及方法

1.4.1血氣分析 通氣240 min后采集各組大鼠頸動脈血，采用自動血氣分析儀測定p(O2)、p(CO2)、血乳酸、實際HCO3-和pH值。

1.4.2血清及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-1β、TNF-α、SOD及p-NF-κB水平 各組大鼠經心臟穿刺放血處死，用預冷的無菌PBS行左側肺泡灌洗，收集BALF，于4 ℃下以1 500 r/min的轉速離心12 min，收集上清液，-80 ℃保存。經劍突下往上縱向剪開胸骨,暴露胸膜(勿傷及肺組織)，打開胸腔，22G穿刺針于左心室取血，于4 ℃下以1 500 r/min的轉速離心12 min后取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫法(ELISA)測定，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4.3肺組織濕干比 分離各組大鼠右側肺組織，取右肺上葉，用無菌紗布沾干表面水分,置入潔凈玻璃皿,精確稱質量(即濕質量),于68 ℃恒溫烤箱中烘烤24 h至恒重，測定肺組織質量(即干質量),根據肺組織濕干比評估肺水腫程度。

1.4.4肺組織病理表現(xiàn)和病理學評分 取右肺中葉肺組織，用4%甲醛固定24 h,經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片,蘇木精-伊紅(HE)染色后，光鏡下觀察肺組織病理學變化并評分。病理學變化包括肺泡充血、出血、肺泡腔或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集、肺泡壁增厚和/或透明膜形成，視病變輕重評0～4分，0分為無病變或非常輕微,1分為輕度病變,2分為中度病變,3分為重度病變,4分為極重度病變，各項評定分數(shù)相加即為病理學總評分。

1.4.5肺組織中SOD及NF-κB表達情況 采用免疫蛋白印跡法(Western blot)檢測。從-80 ℃冰箱取各組大鼠右肺下葉肺組織標本50 mg，用RIPA+PMSF法提取蛋白；按BCA試劑盒說明書將蛋白稀釋配比，經100 ℃水浴5 min，取各組待測蛋白樣品100 μg分別加入SDS-PAGE凝膠電泳，經濕電轉移至PVDF膜上，封閉液封閉2 h后加入濃度為1∶500的一抗NF-κB mAb、SOD mAb及β-actin mAb，4 ℃搖床孵育12 h；用1*TBST洗膜(3次×5 min)并在1∶2 000濃度辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗稀釋液中室溫孵育2 h；TBST洗滌3次×5 min，ECL顯色，經ChemiDocTMMP系統(tǒng)掃描，以目的蛋白的灰度值/內參蛋白的灰度值來反映NF-κB及SOD蛋白的表達情況。

2 結 果

2.14組大鼠通氣240 min后血氣結果比較 右美托咪定+烏司他丁組p(O2)、實際HCO3-、pH值均明顯高于其他組(P均<0.05)，p(CO2)、血乳酸均明顯低于其他組(P均<0.05)；右美托咪定組和烏司他丁組p(O2)、實際HCO3-、pH值均明顯高于生理鹽水組(P均<0.05)，p(CO2)、血乳酸均明顯低于生理鹽水組(P均<0.05)，右美托咪定組和烏司他丁組各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 4組大鼠通氣240 min后血氣結果比較

注：①與右美托咪定+烏司他丁組比較，P<0.05；②與生理鹽水組比較，P<0.05；1 mmHg=0.133 kPa。

2.24組大鼠血清及BALF中IL-1β、TNF-α、p-NF-κB、SOD水平比較 右美托咪定+烏司他丁組大鼠血清及BALF中IL-1β、TNF-α、p-NF-κB水平均明顯低于其他組(P均<0.05)，SOD水平明顯高于其他組(P均<0.05)；右美托咪定組和烏司他丁組血清及BALF中IL-1β、TNF-α、p-NF-κB水平均明顯低于生理鹽水組(P均<0.05)，SOD水平均明顯高于生理鹽水組(P均<0.05)，右美托咪定組和烏司他丁組各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 4組大鼠血清及BALF中IL-1β、TNF-α、p-NF-κB、SOD水平比較

注：①與右美托咪定+烏司他丁組比較，P<0.05；②與生理鹽水組比較，P<0.05。

2.34組大鼠肺組織濕干比及病理評分比較 右美托咪定+烏司他丁組肺組織濕干比及病理評分均明顯低于其他組(P均<0.05)，4組間肺組織濕干比比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；烏司他丁組和右美托咪定組病理評分均明顯低于生理鹽水組(P均<0.05)，但2組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 4組大鼠肺組織濕干比及病理評分比較

2.44組大鼠肺組織HE染色表現(xiàn) 生理鹽水組大鼠肺組織有明顯水腫、充血，肺泡間隔增寬且部分有融合；烏司他丁組及右美托咪定組除細支氣管附近有少量充血水腫外，大部分水腫較輕，間隔清晰；右美托咪定+烏司他丁組肺泡大小相對固定，充血水腫最輕。見圖1～4。

圖1 生理鹽水組大鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×100)

2.54組大鼠肺組織中SOD及NF-κB表達情況比較 右美托咪定+烏司他丁組SOD蛋白表達灰度值最高，其次為烏司他丁組、右美托咪定組及生理鹽水組，而右美托咪定+烏司他丁組NF-κB蛋白表達灰度值最低，其次為右美托咪定組、烏司他丁組及生理鹽水組。見圖5。

圖2 烏司他丁組大鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖3 右美托咪定組大鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×100)

圖4 右美托咪定+烏司他丁組大鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×100)

3 討 論

機械通氣是改善危重患者缺氧或低氧血癥的最直接有效手段，也是目前全身麻醉手術患者維持氧合的最常用方式,但不合理的使用機械通氣可導致肺泡上皮、毛細血管內皮的結構及功能發(fā)生變化，繼發(fā)VILI。相關研究顯示，對經歷長時間持續(xù)機械通氣的無肺功能基礎疾病的患者，VILI致死率為15%，而對于患有肺癌或其他肺部疾病的患者，VILI致死率可達59%[8-9]。

圖5 4組大鼠肺組織中SOD及NF-κB表達情況

目前研究認為VILI主要是由生物性的肺損傷引起，與肺部及全身炎癥反應密切相關[10]，機制主要包括促炎遞質與抗炎遞質的失調、氧化應激反應的失衡、炎癥刺激細胞結構及骨架的重塑、炎癥反應繼發(fā)的上皮細胞間質化改變以及細胞凋亡基因的激活等[11]。SOD與活性氧(ROS)是維持機體氧化/抗氧化平衡的關鍵蛋白之一，由于ROS在體內欠穩(wěn)定，直接檢測血液或組織中ROS含量可能與實際情況存在較大偏差，故選擇更為穩(wěn)定的SOD作為ROS的反映指標。NF-κB是諸多炎癥信號通路的關鍵蛋白，激活NF-κB即可引發(fā)一系列的炎癥“瀑布效應”，檢測該指標對深入研究藥物間的作用機制具有重要意義。p-NF-κB是NF-κB的磷酸化形式，通過檢測p-NF-κB可更準確地反映NF-κB的含量變化。

烏司他丁是一種尿胰蛋白酶抑制劑，為內源性的抑炎藥物，因其具有抑制溶酶體水解酶的釋放、減少心肌抑制因子的生成、抑制氧自由基的產生及炎癥遞質的釋放[12]，從而起到器官功能的保護作用，在重癥胰腺炎、心肌炎、膿毒血癥、心臟瓣膜置換術等疾病中得以廣泛應用。實驗研究顯示，烏司他丁能通過抑制體內IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子釋放降低脂多糖誘導的兔急性肺損傷的炎癥反應，其還能夠減輕小鼠及兔肺組織的出血及水腫程度，對急性肺損傷具有保護作用[13-14]。右美托咪定是一種新型鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥物，其主要通過選擇性地激活α2受體發(fā)揮上述作用。近來研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定還可通過促進膽堿能遞質的釋放起到抑制IL-1β介導的炎癥反應作用[15-16]，也可能通過抑制巨噬細胞或單核細胞內TLRs/NF-κB/HMGB1蛋白信號通路的激活發(fā)揮抗炎作用[17-18]。

本實驗血氣分析結果顯示，右美托咪定及烏司他丁均能影響VILI模型大鼠pH值、實際HCO3-、p(O2)、p(CO2)及血乳酸值等，使機體維持更高的血氧分壓或氧合功能，抑制p(CO2)升高，減少因乳酸堆積或實際HCO3-消耗過多引發(fā)的酸中毒，而聯(lián)合用藥則能更好地調節(jié)VILI導致的機體酸堿內環(huán)境紊亂；組織病理學結果顯示，右美托咪定與烏司他丁聯(lián)合應用不僅可減輕機械通氣所致的肺充血、水腫及炎性滲出，還可降低肺組織的病理評分；血清及BALF中IL-1β、TNF-α、p-NF-κB、SOD水平變化，結合SOD及NF-κB的蛋白免疫印跡實驗，提示聯(lián)合用藥抑制機體炎癥及氧化反應作用比單獨應用效果更強，這可能與藥物間的相互協(xié)同作用有關。

綜上所述，右美托咪定聯(lián)合烏司他丁能增強機體抗氧化及抑制炎癥遞質釋放的能力，對大鼠VILI起到較好的保護作用，為VILI的治療提供了一定理論依據。

[1] Jia X,Malhotra A,Saeed M,et al. Risk factors for ARDS in patients receiving mechanical ventilation for>48 h[J]. Chest,2008,133(4):853-861

[2] Guay J,Ochroch EA. Intraoperative use of low volume ventilation to decrease postoperative mortality,mechanical ventilation,lengths of stay and lung injury in patients without acute lung injury[J]. Cochrane Database Syst Rev,2015(12):CD011151

[3] Ko YA,Yang MC,Huang HT,et al. NF-κB activation in myeloid cells mediates ventilator-induced lung injury[J]. Respir Res,2013,14(1):69

[4] Kuipers MT,Vogl T,Aslami H,et al. High levels of S100A8/A9 proteins aggravate ventilator-induced lung injury via TLR4 signaling[J]. PLoS One,2013,8(7):e68694

[5] Wu J,Yan Z,Schwartz DE,et al. Activation of NLRP3 inflammasome in alveolar macrophages contributes to mechanical stretch-induced lung inflammation and injury[J]. J Immunol,2013,190(7):3590-3599

[6] Dai H,Pan L,Lin F,et al. Mechanical ventilation modulates Toll-like receptors 2,4,and 9 on alveolar macrophages in a ventilator-induced lung injury model[J]. J Thorac Dis,2015,7(4):616-624

[7] Seitz DH,Palmer A,Niesler U,et al. Altered expression of Fas receptor on alveolar macrophages and inflammatory effects of soluble Fas ligand following blunt chest trauma[J]. Shock,2011,35(6):610-617

[8] Andréjak C,Terzi N,Thielen S,et al. Admission of advanced lung cancer patients to intensive care unit:a retrospective study of 76 patients[J]. BMC Cancer,2011,11:159

[9] Shih CY,Hung MC,Lu HM,et al. Incidence, life expectancy and prognostic factors in cancer patients under prolonged mechanical ventilation:a nationwide analysis of 5,138 cases during 1998-2007[J]. Crit Care,2013,17(4):R144

[10] Gao W,Ju YN. Budesonide attenuates ventilator-induced lung injury in a rat model of inflammatory acute respiratory distress syndrome[J]. Arch Med Res,2016,47(4):275-284

[11] Scheiermann J,Klinman DM. Suppressive oligonucleotides inhibit inflammation in a murine model of mechanical ventilator induced lung injury[J]. J Thorac Dis,2016,8(9):2434-2443

[12] Umeadi C,Kandeel F,Al-Abdullah IH. Ulinastatin is a novel protease inhibitor and neutral protease activator[J]. Transplant Proc,2008,40(2):387-389

[13] Gao C,Li R,Wang S. Ulinastatin protects pulmonary tissues from lipopolysaccharide-induced injury as an immunomodulator[J]. J Trauma Acute Care Surg,2012,72(1):169-176

[14] Qiu X,Ji S,Wang J,et al. The therapeutic efficacy of ulinastatin for rats with smoking inhalation injury[J]. Int Immunopharmacol,2012,14(3):289-295

[15] Xiang H,Hu B,Li Z,et al. Dexmedetomidine controls systemic cytokine levels through the cholinergic anti-inflammatory pathway[J]. Inflammation,2014,37(5):1763-1770

[16] Wu X,Song X,Li N,et al. Protective effects of dexmedetomidine on blunt chest trauma-induced pulmonary contusion in rats[J]. J Trauma Acute Care Surg,2013,74(2):524-530

[17] Chen C,Zhang Z,Chen K,et al. Dexmedetomidine regulates inflammatory molecules contributing to ventilator-induced lung injury in dogs[J]. J Surg Res,2014,187(1):211-218

[18] Chang Y,Huang X,Liu Z,et al. Dexmedetomidine inhibits the secretion of high mobility group box 1 from lipopolysaccharide-activated macrophages in vitro[J]. J Surg Res,2013,181(2):308-314