任璐,劉思雨,鐘燕,索化夷*
(1.西南大學 食品科學學院,重慶 400715;2.重慶第二師范學院 重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶 400067)
參與豆豉發(fā)酵的微生物與豆豉品質(zhì)、風味及酶活等密切相關(guān)。豆豉制曲階段的優(yōu)勢霉菌是總狀毛霉[5],豆豉中纖維素酶、蛋白酶等酶活性決定了粗纖維、蛋白質(zhì)等降解速度,影響豆豉的色澤變化、質(zhì)構(gòu)變化[6]。毛霉型豆豉采用自然發(fā)酵工藝,發(fā)酵周期長,沒有一種優(yōu)良而穩(wěn)定的發(fā)酵劑。張雨浩等[7]發(fā)現(xiàn)酶通過催化蛋白質(zhì)降解,為黑色素形成提供底物。孫森等[8]分析了天然發(fā)酵豆豉中的微生物菌相及關(guān)鍵酶酶活變化。目前對毛霉型豆豉微生物區(qū)系、黑色素形成機理等方面的深入研究較多,但對毛霉菌株發(fā)酵能力的評價較少。
本文從永川豆豉和三臺豆豉中分離得到2株總狀毛霉,對其蛋白酶、纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的酶活力進行分析,對傳統(tǒng)毛霉型菌株間的差異做一簡要闡述,為毛霉型豆豉安全高效發(fā)酵劑的研發(fā),實現(xiàn)豆豉的規(guī)?;I(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
該實驗材料采自永川豆豉食品有限公司和四川省三臺縣三臺農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限責任公司。
美國OMEGA公司生產(chǎn)的真菌DNA提取試劑盒(Fungal DNA Min Kit)、dNTP Mixture(10 mmol/L)、Taq Plus(5 U/μL)、10×Taq Plus Buffer(含Mg2+)、6×DNA Loading Buffer、λDNA/HindⅢMarker、LD2000 plus DNA Ladder、Gold View Ⅰ型核酸染料、50×TAE;
福林試劑(Folin試劑)、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、三氯乙酸、干酪素、水楊素等均為分析純(AR);
馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)[9]、麩皮培養(yǎng)基。
Mini-PROTEAN Tetro Cell核酸電泳系統(tǒng) 美國Bio-RAD公司;G:Box EF 凝膠成像系統(tǒng) 英國Syngene公司;EDC-810 雙槽PCR儀 東勝創(chuàng)新生物科技有限公司;光學顯微鏡。
1.4.1 毛霉的分離純化
取永川豆豉樣品25 g至錐形瓶中,加225 mL滅菌純水,于攪拌器上攪拌均勻。取1 mL上清液于EP管中,即為10-1稀釋度的樣液,依次按10倍稀釋6次,分別得到10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7稀釋度的樣液。取0.1 mL不同稀釋度的樣液,涂布PDA平板,每種稀釋度做3個平行平板,倒置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔24 h觀察1次。3~5天后根據(jù)菌落形態(tài)和孢子顏色分離平板上生長的所有菌種,在PDA平板中劃線接種于28 ℃培養(yǎng),3~5天后重復分離步驟,直至分離出所有純化菌種,并在光學顯微鏡下觀察找到毛霉菌落。三臺豆豉做相同處理。
1.4.2 分離菌株的分子生物學鑒定
1.4.2.1 DNA的提取
參考Chen等[10]的方法,用真菌DNA試劑盒(Fungal DNA Min Kit)提取毛霉DNA。
1.4.2.2 PCR擴增
取5 μL引物NS1(5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')、5 μL引物Fung(5'-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3')、5 μL dNTP Mixture(10 mmol/L)、5 μL Taq Plus(5 U/μL)、25 μL 10×Taq Plus Buffer(含Mg2+)和195 μL滅菌超純水混勻。取24 μL混合液與1 μL提取的DNA樣品配成PCR體系,另取24 μL混合液加入1 μL滅菌超純水作空白,放入PCR儀中進行相應(yīng)的PCR,得到PCR擴增產(chǎn)物。
1.4.2.3 DNA的電泳
選用0.8%的瓊脂糖凝膠,5 μL λDNA/HindⅢMarker加入樣品池的一端,1 μL 6×DNA Loading Buffer與5 μL DNA樣品混勻后依次加入樣品池。在80 V恒定電壓下電泳50 min,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并分析。
用1.4%的瓊脂糖凝膠對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測,5 μL D2000plus DNA Ladder加入樣品池的一端,其他條件同上。
1.4.2.4 測序與鑒定
PCR產(chǎn)物測序由華大基因完成,測序結(jié)果通過NCBI中的BLAST程序?qū)ふ遗c其有最大同源性的序列,最終確定2株菌的種屬關(guān)系。
1.4.3 測定酶活
1.4.3.1 制備待測酶液
純化的毛霉接種到麩皮培養(yǎng)基,培養(yǎng)48天后加pH為7.2的磷酸緩沖液10 mL,破碎后在40 ℃抽提1 h,離心(3500 r/min),離心液備用。
1.4.3.2 蛋白酶活測定
參照GB/T 23527-2009的方法測定[11]。
繪制標準曲線:以不同濃度的酪氨酸與福林試劑反應(yīng)測出的OD660值為橫坐標,酪氨酸的濃度為縱坐標,繪制成標準曲線。
取待測離心液1 mL于40 ℃水浴預熱2 min,加1 mL同樣預熱的酪蛋白,精確保溫10 min后加0.4 mol三氯乙酸2 mL,保溫20 min使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心。另取試管加濾液1 mL,0.4 mol碳酸鈉5 mL和福林試劑1 mL,搖勻后40 ℃保溫發(fā)色20 min并進行光密度(OD)測定。每個樣品做3個平行和空白對照??瞻讓嶒炘诩永业鞍字跋燃?.4 mol三氯乙酸2 mL使酶失活,其他測定方法相同。
結(jié)果處理得到樣品蛋白酶活力單位如下:
式中:A為由樣品測得OD值,查標準曲線得相當?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)(或OD值×K);4為4 mL反應(yīng)液取出1 mL測定;N為酶液稀釋的倍數(shù);10為反應(yīng)10 min;W為樣品水分百分含量。
1.4.3.3 纖維素總體酶活測定(FPA活力單位測定)
繪制標準曲線:取不同濃度的標準葡萄糖溶液和DNS顯色劑各2 mL,沸水浴10 min后定容至15 mL,測OD550值。以O(shè)D值為橫坐標,葡萄糖的mg數(shù)為縱坐標繪制標準曲線。
試管內(nèi)加0.2 mL待測酶液和pH為4.8醋酸緩沖液1.8 mL,預熱至50 ℃后加1×6 cm濾紙條,在50 ℃恒溫水浴60 min,加DNS顯色劑2 mL并沸水浴加熱10 min,冷卻后加水至15 mL,測OD550值。
1.4.3.4 β-葡萄糖苷酶活測定(Cb酶活力單位測定)
參照Cheng[12]的方法,改進后進行毛霉β-葡萄糖苷酶活測定。
試管內(nèi)加0.2 mL待測酶液和1.8 mL水楊素(1%),置50 ℃恒溫水浴60 min后加DNS顯色劑2 mL,沸水浴加熱10 min,冷卻后加水至15 mL,測OD550值。
結(jié)果處理,得到纖維素酶活力活力單位如下:
式中:x為樣品OD值的平均值;b和a由葡萄糖濃度和相應(yīng)的OD值通過回歸方程求得;n為酶液稀釋的倍數(shù);T為酶促反應(yīng)的時間;0.2為所加酶液的量。
提取不同毛霉的總DNA時,YC-1在Marker 23130 bp附近出現(xiàn)條帶,條帶完整,樣本提取成功,得到目的片段。
圖1 提取不同毛霉的DNA片段的圖像Fig.1 The image of DNA's fragment extraction from different mucor
注:M為Marker,1為空白,2和3為YC-1,4和5為ST-1。
由圖1可知,提取不同毛霉的DNA片段時,在Marker附近出現(xiàn)2,4,5號3條條帶,條帶清晰明亮,陰性對照無條帶,2個樣本擴增成功。
表1 兩株菌種的鑒定Table 1 Identification of two kinds of strains
由表1可知,菌株YC-1和ST-1鑒定成功,片段長度分別為677和679,同源性都為99%,鑒定出2株菌種皆為總狀毛霉。
圖2 酪氨酸標準曲線Fig.2 Standard curve of tyrosine
根據(jù)標準曲線計算樣品的蛋白酶活。在40 ℃下每1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸,定義為1個蛋白酶活力單位。
圖3 葡萄糖標準曲線Fig.3 Standard curve of glucose
由圖3可知,樣品的纖維素總體酶活和β-葡萄糖苷酶活。1 mL酶液在50 ℃,pH為4.8條件下,每1 min水解1×6 cm的濾紙產(chǎn)生1 μg還原糖(以葡萄糖計)的酶量定義為1個纖維素總體酶活力單位。1 mL酶液于50 ℃,pH為4.8條件下,每1 min水解1%水楊素溶液產(chǎn)生1 μg還原糖(以葡萄糖計)的酶量定義為1個β-葡萄糖苷酶活力單位。
表2 兩種毛霉的酶活比較Table 2 Comparison of enzyme activities of two kinds of mucor U/mL
蛋白酶活性是評價豆豉發(fā)酵過程的重要指標,蛋白酶將大分子蛋白水解成小分子多肽和氨基酸以及各種香氣成分。蛋白酶活性高低反映了豆豉中蛋白質(zhì)水解的速度,決定了豆豉發(fā)酵成熟的周期[13]。在以蛋白質(zhì)為主要成分的大豆制品中,蛋白酶活力的高低對豆豉發(fā)酵過程及蛋白質(zhì)降解有重要影響。如果豉曲的質(zhì)量不高,分泌的蛋白酶不足,影響成品成熟時間和營養(yǎng)價值[14]。
由表2可知,YC-1和ST-1的蛋白酶活分別為176.891 U/mL和51.201 U/mL,且YC-1的蛋白酶活性明顯高于ST-1。與索化夷等研究發(fā)現(xiàn)永川豆豉制曲過程中酸性蛋白酶的最高酶活性291 U/g相比較低,發(fā)酵后階段永川豆豉蛋白酶活力降低到50~175 U/g。在自然發(fā)酵條件下,曲霉型自然發(fā)酵豆豉過程中的蛋白酶活性最高為190.24 U/g[15,16],與YC-1相比差異不大,與ST-1的差異很大。在曲霉型和毛霉型豆豉研究中也表明可以通過降低食鹽含量,提高蛋白酶活性的方法縮短發(fā)酵周期。選育高活性蛋白酶產(chǎn)生菌是縮短發(fā)酵周期和提高風味最簡單和行之有效的方法[17]。
豆豉發(fā)酵過程中纖維素酶活性高低決定了大豆纖維素的降解程度,大豆纖維素的降解會降低豆豉的硬度、彈性和咀嚼度等質(zhì)構(gòu)指標。由表2的測定結(jié)果發(fā)現(xiàn),YC-1和ST-1的纖維素總體酶活分別為107.645 U/mL和66.762 U/mL,YC-1的酶活顯著高于ST-1的酶活。索化夷等[18]發(fā)現(xiàn)在毛霉型制曲階段,豆豉纖維素酶活由發(fā)酵初期的0.54 U/g上升到制曲結(jié)束時的1.37 U/g,進入后發(fā)酵階段纖維素酶的活性開始下降,在豆豉成熟時僅為0.03 U/g。以上表明YC-1和ST-1的纖維素總體酶活較高,其中YC-1的酶活高于ST-1的酶活。
微生物分泌β-葡萄糖苷酶作用于異黃酮糖苷,將大豆中糖苷型異黃酮向苷元型異黃酮轉(zhuǎn)化,而苷元型異黃酮更具有功能活性。因而,對β-葡萄糖苷酶活性的研究有助于提高發(fā)酵豆制品的功能物質(zhì)。由表2可知,YC-1和ST-1的β-葡萄糖苷酶活分別為80.430 U/mL和95.362 U/mL,且ST-1的酶活稍高于YC-1的酶活。β-葡萄糖苷酶作用于異黃酮,增強了發(fā)酵豆制品的功能性,為功能性豆豉的生產(chǎn)提供了參考。
毛霉是毛霉型豆豉發(fā)酵的主要菌株,其優(yōu)勢霉菌是總狀毛霉。從永川豆豉和三臺豆豉中分離到2株毛霉YC-1和ST-1,經(jīng)分離、純化、測序,鑒定為總狀毛霉。
2株總狀毛霉3種酶的酶活不同,YC-1和ST-1產(chǎn)蛋白酶活分別為176.891 U/mL和51.201 U/mL;產(chǎn)纖維素總體酶活分別為107.645 U/mL和66.762 U/mL;產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活分別為80.430 U/mL和95.362 U/mL??傮w來說,YC-1酶活力情況高于ST-1的酶活力。
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