發(fā)酵菌融合蛋白中鮮味八肽的分離純化工藝優(yōu)化

張崟，熊偉，郭思亞，唐歡，劉玉應(yīng)，李茜雅，黃偉民

(1.成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610106；2.西藏藥業(yè) 成都諾迪康生物制藥有限公司，成都 610106)

鮮味對(duì)食品的風(fēng)味和消費(fèi)者對(duì)食品的喜好程度有重要影響，因此鮮味和鮮味增效劑的研究與開(kāi)發(fā)受到國(guó)內(nèi)外的廣泛重視。近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的鮮味及鮮味增強(qiáng)劑有谷氨酸鈉、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物及鮮味肽等[1]，其中鮮味肽的發(fā)現(xiàn)受到國(guó)內(nèi)外較多關(guān)注。自Yamasaki等在1978年從牛肉的木瓜蛋白酶酶解液中分離純化出一種鮮味八肽(Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala， LGAGGSLA)以來(lái)[2]，國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)該肽的風(fēng)味研究出現(xiàn)了較多爭(zhēng)議[3]。Tamura和Wang等[4，5]采用化學(xué)合成LGAGGSLA后研究其呈味效果，認(rèn)為其呈現(xiàn)鮮味，但Van Wassenaar卻得出LGAGGSLA根本沒(méi)有鮮味。

綜合分析近年來(lái)有關(guān)鮮味肽LGAGGSLA呈味效果的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用化學(xué)合成該肽，然后驗(yàn)證其呈味效果的方法可能存在缺陷。原因是化學(xué)合成肽時(shí)可能會(huì)因?yàn)楦狈磻?yīng)而導(dǎo)致肽的風(fēng)味出現(xiàn)差異。為了采用不同的方法驗(yàn)證該肽的呈味效果，課題組構(gòu)建了LGAGGSLA的大腸桿菌工程菌，通過(guò)基因表達(dá)法獲取生物源LGAGGSLA，進(jìn)而驗(yàn)證其呈鮮效果[6]。由于工程菌表達(dá)后得到的是融合蛋白，需要經(jīng)過(guò)酶切后才能獲得鮮味八肽，所以本文對(duì)融合蛋白的酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期最大量地獲得生物源鮮味八肽。這不僅有利于大規(guī)模制備LGAGGSLA純品，而且將為后期工業(yè)化生產(chǎn)鮮味肽提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鮮味八肽LGAGGSLA工程菌菌種自備。IPTG、低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自上海生物工程公司。SRP6215-50UG EK酶(<2 EU/μg)購(gòu)自美國(guó)Sigma試劑公司。實(shí)驗(yàn)中所用其他試劑均為分析純。

Agilent 1260高效液相色譜(Agilent)，AKTA Purifier層析系統(tǒng)(GE)，Mini-PROTEAN電泳儀(BIO-RAD)，TS-2脫色搖床(Kylin-Bell)，APV1000高壓勻漿機(jī)(丹麥APV)，J2-HS離心機(jī)(Backman)，B.BRAUN發(fā)酵罐(德國(guó)貝朗)，HWY211搖床(上海五相儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)條件

搖床培養(yǎng)條件參考文獻(xiàn)[6]。菌種按1%接種于LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL Amp)，在37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)過(guò)夜。次日，按5%接種量轉(zhuǎn)接新鮮液體LB(含100 μg/mL Amp)中37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600值約為0.6。加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，28 ℃，200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。

1.2.2 發(fā)酵罐中試培養(yǎng)條件

銜接搖床培養(yǎng)最優(yōu)發(fā)酵條件，并參考文獻(xiàn)[7]，采用新鮮液體LB(含100 μg/mL Amp)，上罐種子培養(yǎng)基2 L，溶氧維持在 25%左右，培養(yǎng)4 h后待培菌體OD值約為1.6時(shí)，注入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在28 ℃的環(huán)境下連續(xù)誘導(dǎo)發(fā)酵24 h，發(fā)酵罐實(shí)際培養(yǎng)基體積20 L，得到菌體300 g，表達(dá)量20%左右。

1.2.3 融合蛋白分離純化

采用J2-HS離心機(jī)在8000 r/min下離心10 min，離心8次得菌體300 g，表達(dá)量20%左右，分子量約為18 kD。菌體分裝于-20 ℃保存。將菌體100 g于4 ℃解凍過(guò)夜。用配制好的破菌緩沖液(20 mmol/L Tris，pH 8.0)按菌體濕重1∶10進(jìn)行均勻懸浮菌體。設(shè)定高壓勻漿機(jī)壓力參數(shù)為500～700 bar，破菌3次，每次破菌前向樣品中直接加入-20 ℃的碎冰(用破菌緩沖液制備)冷卻樣品。菌體破菌液經(jīng)涂片、染色后鏡檢，其破菌率應(yīng)不小于95%。菌體破菌液經(jīng)9000 r/min，30 min離心，得到上清液。再用0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾得濾液。經(jīng)Chelating Sepharose Fast Flow親和層析，采用20 mmol/L Tris、10 mmol/L咪唑，在pH 8.0洗滌目的蛋白。

1.2.4 融合蛋白酶切率

采用15%的分離膠和5%的濃縮膠制作電泳膠。起始電流15 mA，待樣品進(jìn)入分離膠之后，調(diào)整為30 mA進(jìn)行電泳。電泳膠脫色后，采用Gel-Pro analyzer 4.0計(jì)算電泳膠中目標(biāo)蛋白酶切前后的光密度值(Optical Density，O.D.值)。根據(jù)O.D.值計(jì)算目標(biāo)蛋白的EK酶酶切效率[8]。酶切效率(%)=O.D.目的蛋白酶切后/O.D.目的蛋白原始×100。

1.2.5 酶切條件優(yōu)化

采用3因素、1響應(yīng)、5中心的Small Composite響應(yīng)面法對(duì)酶切條件進(jìn)行優(yōu)化。參照文獻(xiàn)[9]，選擇EK酶用量1～3 μL/mL，酶解時(shí)間10～20 h，酶解溫度8～40 ℃為單因素取值區(qū)間，以融合蛋白的酶切效率為影響值。各因素編碼及水平見(jiàn)表1，所得實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)表2。

表1 各因素水平及編碼Table 1 Levels and codes of each factor

1.2.6 鮮味肽分離純化

采用Chelating Sepharose Fast Flow親和層析對(duì)過(guò)濾后酶切上清液再純化。CV=100 mL，流速10 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。以pH 8.0的20 mmol/L Tris為平衡液并平洗，以pH 8.0的20 mmol/L Tris、100 mmol/L咪唑混合液洗雜蛋白，收集上樣穿透液。

上樣穿透液采用Source15 RPC反向?qū)游黾兓?，CV=75 mL，流速8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。以A液(H2O+0.1%TFA)為平衡液，以B液(乙腈+0.1%TFA)為梯度洗脫，采用A液0.0%～B液100%，10 CV進(jìn)行梯度洗脫。收集目的蛋白洗脫峰。

目的蛋白經(jīng)SP Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換層析純化，CV=50 mL，流速10 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。以pH 4.0的20 mmol/L NaAC為平衡液，用緩沖液(20 mmol/L NaAC，pH 4.0)稀釋目的蛋白5倍再上樣，以pH 4.0的20 mmol/L NaAC平洗，以pH 8.0的20 mmol/L Tris、0.4 mol/L NaCl洗目的蛋白，收集目的蛋白洗脫峰。

1.2.7 鮮味肽的HPLC純度和含量檢測(cè)

以人工合成鮮味八肽為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Agilent 1260，以A(0.1%TFA的水溶液)和B(0.1%TFA的甲基氰溶液)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相流速1.0 mL/min，溫度30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.0設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案，并對(duì)擬合模型的顯著性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 融合蛋白工業(yè)化表達(dá)

根據(jù)分子量計(jì)算，八肽LGAGGSLA約占融合蛋白的5%，含量較低。為了更多地獲得大量的生物源LGAGGSLA，工業(yè)化發(fā)酵工程菌非常必需。為此，本文采用工業(yè)制備級(jí)發(fā)酵罐制備融合蛋白。以文獻(xiàn)[9]中的搖床培養(yǎng)表達(dá)效果及工藝優(yōu)化條件為參考，對(duì)工程菌種進(jìn)行搖床發(fā)酵和中式發(fā)酵，采用SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)其表達(dá)效果進(jìn)行了比較，所得工程菌發(fā)酵表達(dá)融合蛋白效果見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵罐表達(dá)電泳圖片F(xiàn)ig.1 Electrophoretic diagram of fermentor

注：Marker 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，kD；1為未誘導(dǎo)工程菌表達(dá)；2～5為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白。

圖1中泳道1為未經(jīng)誘導(dǎo)工程菌種胞內(nèi)蛋白電泳圖，泳道2～5為工程菌在發(fā)酵罐中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵后胞內(nèi)蛋白電泳圖。比較泳道1和泳道2～5可以發(fā)現(xiàn)，工程菌在誘導(dǎo)前后均能表達(dá)，但是泳道1顯示未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的工程菌目的融合蛋白表達(dá)不明顯，泳道2～5顯示工程菌在發(fā)酵罐中能正常誘導(dǎo)表達(dá)，并且目的融合蛋白有明顯表達(dá)。與標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker進(jìn)行比較可知，表達(dá)的融合蛋白分子量在18 kD左右，這與目的融合蛋白理論分子量17.9 kD相吻合。因此，采用工業(yè)化發(fā)酵表達(dá)能獲取預(yù)期表達(dá)效果。

2.2 EK酶酶切條件優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

八肽LGAGGSLA工程菌經(jīng)發(fā)酵罐(BO 30 L)培養(yǎng)后，破碎細(xì)胞釋放胞內(nèi)融合蛋白。在得到融合蛋白基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步分離純化鮮味八肽，需用EK酶酶切，使得結(jié)合在融合蛋白上的八肽釋放出來(lái)。由于EK酶的價(jià)格較貴，所以提高酶切效率非常關(guān)鍵。為此，根據(jù)文獻(xiàn)[8]報(bào)道酶切條件，選擇EK酶用量1～3 μL/mL，酶解時(shí)間10～20 h，酶解溫度8～40 ℃為單因素取值區(qū)間，采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶切條件，以獲得最優(yōu)的酶切效果。響應(yīng)面法設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案及所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化方案及結(jié)果Table 2 Response surface optimization program and experimental results

續(xù) 表

注：“Y驗(yàn)證值”指根據(jù)擬合方程計(jì)算得到的酶切率值。

2.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯著性分析

對(duì)表2中酶濃度(X1)、酶切時(shí)間(X2)及酶切溫度(X3)與響應(yīng)值Y酶切率的相關(guān)性進(jìn)行分析，所得顯著性結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 擬合模型顯著性分析Table 3 Significance analysis of fitting model

注：X1，X2，X3及“Y驗(yàn)證值”的含義同表2。

由表3可知，酶濃度(PX1<0.001)、酶切時(shí)間(PX2<0.001)和酶切溫度(PX3<0.001)對(duì)酶切率均有顯著影響。因此，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)展過(guò)程中，EK酶用量、酶切時(shí)間和酶切溫度應(yīng)作為重點(diǎn)控制參數(shù)。

將各因素與響應(yīng)值進(jìn)行擬合，所得擬合的數(shù)據(jù)(見(jiàn)表2)顯示建立的擬合主模型P<0.001，而失擬項(xiàng)P=0.6691>0.001。結(jié)合擬合相關(guān)系數(shù)R2=0.9998可知，通過(guò)擬合得到的擬合模型(式1)具有較好的可靠性。

Y=-69.7907+48.46178X1+10.38159X2+2.085563X3-7.279636X12-0.798681X1X2-0.134434X1X3-0.249185X22-0.028895X2X3-0.023846X33。

(式1)

2.2.3 擬合模型可靠性驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所得擬合模型的有效性，利用擬合模型(式1)計(jì)算了酶切率(表2中“Y驗(yàn)證值”)，并將其與實(shí)驗(yàn)測(cè)定值進(jìn)行比較，所得相對(duì)誤差結(jié)果見(jiàn)表2。表2中相對(duì)誤差值均小于5%。由此可見(jiàn)，所得擬合模型能較好地反映酶切率與酶濃度、酶切溫度和酶切時(shí)間之間的關(guān)系。

2.2.4 酶切工藝優(yōu)化

根據(jù)所得擬合模型(式1)，以響應(yīng)值酶切率為最大值對(duì)酶切工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出酶濃度2.00 μL/mL、酶切時(shí)間15 h、酶切溫度24 ℃時(shí)，所得酶切率最高為93.1%。各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖2。

圖2 酶切率的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface of enzyme digestion rate

注：X1，X2，X3及“Y驗(yàn)證值”的含義同表2。

因此，EK酶酶切融合蛋白制備八肽LGAGGSLA的最優(yōu)工藝應(yīng)為酶濃度2.00 μL/mL、酶切時(shí)間15 h、酶切溫度24 ℃。

2.3 分離肽的定性檢測(cè)

以2.2.4中的最優(yōu)酶切工藝為條件，對(duì)融合蛋白中的八肽LGAGGSLA進(jìn)行酶切，然后用Chelating Sepharose Fast Flow親和層析法分類純化，采用HPLC對(duì)純化后的鮮味八肽與化學(xué)合成的鮮味八肽做定性檢測(cè)，所得結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 純化后八肽LGAGGSLA的高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatography of umami octapeptide LGAGGSLA after purification

由圖3可知，酶切得到的生物源八肽LGAGGSLA(圖3中B)和化學(xué)合成的對(duì)照(圖3中A)的保留時(shí)間基本吻合。通過(guò)峰面積積分可知，所得生物肽的純度高達(dá)98%，這為后期生物源肽的結(jié)構(gòu)分析奠定了良好基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)鮮味八肽LGAGGSLA的工程菌進(jìn)行工業(yè)化發(fā)酵，并對(duì)表達(dá)的融合蛋白中的鮮味肽的酶切工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出工業(yè)化發(fā)酵所得融合蛋白與理論預(yù)測(cè)結(jié)果相符合。通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化酶切工藝，得出EK酶濃度、酶切時(shí)間、酶切溫度與酶切率的相關(guān)性模型，對(duì)所得模型進(jìn)行顯著性分析基礎(chǔ)上，進(jìn)行可靠性驗(yàn)證，得出所得模型能很好地反映酶切率與EK酶濃度、酶切時(shí)間及酶切溫度的相互關(guān)系。利用該模型對(duì)酶切工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出EK酶濃度2 μL/mL、酶切時(shí)間15 h、酶解溫度24 ℃時(shí)，融合蛋白的酶切率最高，酶切率達(dá)93.4%。經(jīng)HPLC驗(yàn)證，分離純化后的鮮味八肽與人工合成的鮮味八肽對(duì)照品的保留時(shí)間基本一致，所得生物源鮮味八肽的純度高達(dá)98%，這為進(jìn)一步驗(yàn)證該肽的構(gòu)效關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

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