微流控技術(shù)在腫瘤血管生成中的應(yīng)用進(jìn)展

馬曉潔，陳巧云，余曦冉

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 腫瘤科，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院2013級(jí)臨床醫(yī)學(xué)系，四川 南充 637000）

微流控芯片是一種新型的技術(shù)平臺(tái)，它利用不同的芯片材料構(gòu)造出微米級(jí)的通道結(jié)構(gòu)，結(jié)合微流體控制技術(shù)，能夠相對精確地再現(xiàn)腫瘤微環(huán)境，并能動(dòng)態(tài)地觀察血管生成過程中腫瘤微環(huán)境所發(fā)生的變化。以其獨(dú)特的優(yōu)勢，有逐漸取代傳統(tǒng)的腫瘤血管生成體外模型的趨勢。本文就微流控在腫瘤血管生成中的應(yīng)用做一綜述。

1 微流控技術(shù)

微流控技術(shù)是研究如何在微米和亞微米尺度下控制微小流體和顆粒的科學(xué)，以分子分析、生化防御、分子生物學(xué)和微機(jī)電系統(tǒng)技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的1個(gè)新興學(xué)科，已在醫(yī)學(xué)方面得到廣泛的研究和應(yīng)用。微流控芯片（microflu-idics）是微流控技術(shù)的具體實(shí)現(xiàn)形式，是目前微全分析系統(tǒng)（micro total analysis system，u-TAS）中發(fā)展最為迅速和熱門的領(lǐng)域。

不同的微流控芯片可以發(fā)揮不同的作用，集成聚碳酸酯多孔膜的雙層通道微芯片裝置可以模擬細(xì)胞的相互作用，而具有多層微通道結(jié)構(gòu)的微流控芯片，能篩選出最利于細(xì)胞生長的芯片通道條件[1]。微流控技術(shù)具有非接觸、精確度高、組織培養(yǎng)、營養(yǎng)供應(yīng)和廢物清除功能等[2]優(yōu)點(diǎn)，而且其與傳統(tǒng)的流體系統(tǒng)相比，具有許多優(yōu)勢尤其是其強(qiáng)大的集成能力，可使實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)、前處理及檢測等流程都能集成到1個(gè)微流控系統(tǒng)中完成。所以該項(xiàng)技術(shù)已在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等眾多科學(xué)領(lǐng)域展示前所未有的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用價(jià)值。

2 腫瘤血管生成模型

腫瘤血管生成是指已存在的毛細(xì)血管網(wǎng)通過“萌芽”或“分叉”等方式生長出新的毛細(xì)血管的過程，其具體形成方式包括了出芽式血管生成[3]、血管生成擬態(tài)[4]、馬賽克血管[5]、血管共選擇[6]、募集內(nèi)皮祖細(xì)胞[7]和淋巴管生成等[8]。

目前傳統(tǒng)的腫瘤血管生成體外模型包括：①內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停菏窃谀[瘤血管生成中內(nèi)皮細(xì)胞大多呈過表達(dá)狀態(tài)為依據(jù)。檢測細(xì)胞增殖常用方法：MTT法、SRB法、[3H]胸腺嘧啶核苷摻入法[9]。其缺點(diǎn)分別為：MTT法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果受到細(xì)胞數(shù)量、MTT濃度、殘留培養(yǎng)液的影響；SRB法只適用于貼壁細(xì)胞，而且操作過程繁瑣，易造成人為誤差；[3H]胸腺嘧啶核苷摻入法不僅要使用具有安全風(fēng)險(xiǎn)的放射性物質(zhì)，而且需要通過細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)藥物來評估藥物對細(xì)胞增殖的影響，以排除藥物毒性作用因素；②細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停喊▌?chuàng)傷愈合模型和Boyden小室模型。這2種模型存在的缺點(diǎn)：創(chuàng)傷愈合模型，操作簡便，但忽視劃傷單層細(xì)胞后傷痕愈合過程中細(xì)胞增殖對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[10]。Boyden小室模型，操作技術(shù)要求高且人為因素影響較大，而計(jì)數(shù)方法不同也會(huì)造成統(tǒng)計(jì)結(jié)果誤差較大[9]；③管腔形成模型：主要是考察內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)表面形成毛細(xì)血管網(wǎng)的能力[11]，該法不能實(shí)現(xiàn)對血管形成過程的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的監(jiān)測；④大鼠動(dòng)脈環(huán)模型：是將包埋于纖維蛋白膠或膠原蛋白膠的大鼠動(dòng)脈環(huán)在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，觀察血管出芽情況的方法[12]。但其缺乏正常的血液循環(huán)系統(tǒng)，使所處的血管環(huán)境脫離腫瘤微環(huán)境而導(dǎo)致其新生的血管的特性上與腫瘤微血管有差異。

腫瘤血管形成是1個(gè)非常復(fù)雜的過程，受多種因子的影響[13]。目前，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法除其自身的缺點(diǎn)外，大多只是通過單因素、二維、甚至靜態(tài)的方式進(jìn)行研究，未能實(shí)現(xiàn)在3D條件下對血管生成過程進(jìn)行動(dòng)態(tài)的、多因子間的研究。而且傳統(tǒng)的體外腫瘤血管生成模型僅僅針對腫瘤和血管的培養(yǎng)，而忽視對腫瘤微環(huán)境對血管生成的影響，缺乏腫瘤微環(huán)境的內(nèi)皮細(xì)胞容易出現(xiàn)分子特征的變化，使得最終獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際存在巨大的差距。為克服上述缺點(diǎn)，構(gòu)建出更接近理想的腫瘤血管生成模型的體外模型成為一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。

3 微流控在腫瘤血管生成中的應(yīng)用

近年來，微流控芯片技術(shù)發(fā)展迅速，在生命科學(xué)尤其是細(xì)胞研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。微流控技術(shù)不光可以模擬腫瘤細(xì)胞生長微環(huán)境，為腫瘤微環(huán)境下的相關(guān)問題研究提供1個(gè)簡便的研究平臺(tái)，還可以給細(xì)胞提供一個(gè)立體的生長環(huán)境，實(shí)現(xiàn)對腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞轉(zhuǎn)移的各種關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)[14]，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞如何適應(yīng)腫瘤微環(huán)境的變化[15]，并可以實(shí)現(xiàn)在可溶性生化因子的濃度梯度分布下腫瘤血管細(xì)胞生長的研究[16]。

3.1 微流控技術(shù)可以輕松解決對培養(yǎng)環(huán)境中流體壓力的精確控制的難題

在腫瘤微環(huán)境內(nèi)高滲性腫瘤血管提高間質(zhì)流體壓力并改變流動(dòng)模式，該異常流體壓力可以通過刺激腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成推動(dòng)腫瘤生長進(jìn)程。BUCHANAN等[17]設(shè)計(jì)的一種體外腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的微流控系統(tǒng)，以探究不同流動(dòng)剪切應(yīng)力對腫瘤血管生成的影響，通過定量轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的分析下游分子，發(fā)現(xiàn)在管腔低流量條件下與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞增加促血管生成基因的表達(dá)。這凸顯出微流控技術(shù)在評估內(nèi)皮和腫瘤細(xì)胞對不同流動(dòng)剪切應(yīng)力條件下腫瘤血管生成反應(yīng)的優(yōu)勢。

3.2 微流控技術(shù)可以再現(xiàn)腫瘤微環(huán)境

由腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)及其分泌的生長因子參與組成的腫瘤生長局部穩(wěn)態(tài)環(huán)境，稱為腫瘤微環(huán)境。目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管的生成與微環(huán)境中各因素的變化著密切的關(guān)系[18]。微流控技術(shù)可模擬腫瘤微環(huán)境，研究其對腫瘤血管生成的影響。STROOCK等[19]構(gòu)建一微流控平臺(tái)，能夠很好地實(shí)現(xiàn)對腫瘤微環(huán)境的再現(xiàn)，包括大部分由腫瘤細(xì)胞組成的混合細(xì)胞群及其周圍的間質(zhì)細(xì)胞和由內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)襯的血管，并通過仿生灌注免疫細(xì)胞來模擬其被運(yùn)輸和招募的過程。這實(shí)現(xiàn)對腫瘤微環(huán)境的近似模擬，使得構(gòu)建出的模型更接近體內(nèi)腫瘤微環(huán)境。

傳統(tǒng)體外模型往往因其無法控制生化梯度和獲取單細(xì)胞水平的圖像而停滯不前。微流控技術(shù)下的體外模型可很好彌補(bǔ)這點(diǎn)缺憾。CHUNG等[20]制作一種新型微流控平臺(tái)，在這個(gè)平臺(tái)上通過訪問圖像來實(shí)現(xiàn)對生化和生物力學(xué)因素的采集，可以清楚地觀察到Mtln3癌細(xì)胞系吸引的內(nèi)皮細(xì)胞和誘導(dǎo)血管生成的過程，與此同時(shí)還能實(shí)現(xiàn)對內(nèi)皮細(xì)胞與癌細(xì)胞共培養(yǎng)環(huán)境中的機(jī)械、生化因素的精確控制，來完成對腫瘤血管生成的影響因素進(jìn)一步探討。LEE等[21]提出有關(guān)于轉(zhuǎn)移腫瘤產(chǎn)生微血管的微流控芯片，與其他模型相比其優(yōu)點(diǎn)在于腫瘤血管生成過程中癌組織與血管接口可實(shí)現(xiàn)精確成像，并對血管生成反應(yīng)和腫瘤細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移的定量分析。

3.3 微流控技術(shù)能實(shí)現(xiàn)對腫瘤血管的特性的模擬還原

腫瘤血管不同于正常組織血管，其特性表現(xiàn)為：①血管結(jié)構(gòu)扭曲多變，管徑大小不一；②血管壁薄而具有高度通透性；③血管血流紊亂，常靜止不流動(dòng)或倒流[22]。該腫瘤血管的特性在傳統(tǒng)的體外血管生成模型常未被考慮，而微流控卻能憑借自身優(yōu)勢實(shí)現(xiàn)對腫瘤血管的特性進(jìn)行模擬還原。對此翟萬銀等[23]運(yùn)用微加工技術(shù)，構(gòu)建腫瘤血管微流控芯片。該芯片不僅能夠控制微管道內(nèi)液體的流動(dòng)方向和速度，實(shí)現(xiàn)腫瘤血管內(nèi)血液流向、流速的多變特點(diǎn)的模擬，并能節(jié)段性地調(diào)整微縫段管道的流向和流速模擬扭曲和粗細(xì)變化不均的腫瘤血管結(jié)構(gòu)，還能通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移而使得血管出現(xiàn)穩(wěn)定的泄漏點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對腫瘤血管高通透性的特點(diǎn)進(jìn)行再現(xiàn)，這使得構(gòu)建出的腫瘤血管更接近真實(shí)情況。

3.4 微流控技術(shù)可重建體內(nèi)血管出芽形成過程

出芽式血管生成是腫瘤血管生成的主要方式。傳統(tǒng)體外模型不能模擬出從內(nèi)皮細(xì)胞到尖端細(xì)胞及柄細(xì)胞演變的動(dòng)態(tài)過程，而微流控技術(shù)在細(xì)胞的定性、定量研究和增強(qiáng)成像以及內(nèi)部生物控制能力上的優(yōu)勢，能夠再現(xiàn)該過程。

NGUYEN等[24]構(gòu)建一種三維出芽式血管生成的微流控模型，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地觀察到與體內(nèi)出芽式血管生成標(biāo)志結(jié)構(gòu)一致的特征，由此表明該三維微流控模型能夠很好重建體內(nèi)血管出芽形成過程，有助于人們對該過程中所受影響因素展開研究。VERBRIDGE等[25]制作一種微流控模型，通過該仿生模型可觀察在血管內(nèi)皮生長因子的空間梯度變化下內(nèi)皮細(xì)胞涂層血管的出芽情況，并能夠?qū)崿F(xiàn)微流控平臺(tái)上生物和物理參數(shù)的調(diào)節(jié)。JEONG等[26]構(gòu)建一微流控平臺(tái)，通過其不僅能夠精確控制內(nèi)皮細(xì)胞的化學(xué)刺激，而且具備優(yōu)良的光學(xué)分辨率和原位監(jiān)測在化學(xué)梯度變化下的細(xì)胞形態(tài)的改變，這使得出芽式血管生成的整個(gè)動(dòng)態(tài)演變過程能得到真實(shí)的反應(yīng)。

3.5 微流控在腫瘤血管生成應(yīng)用中存在的缺陷

微流控技術(shù)成功地用用宏觀尺度的方法來真實(shí)地模擬血管的生成、入侵及外滲，并取得可喜的成果。但即使是目前最先進(jìn)的三維微血管灌注式模型仍然不不具備趨化因子梯度定向誘導(dǎo)癌細(xì)胞趨化遷移的能力，且新生血管網(wǎng)的幾何結(jié)構(gòu)也難以預(yù)測[27]。有研究者試圖克服該問題，HYUNJAE等[28]人建立1個(gè)模型，能實(shí)現(xiàn)清楚地成像和定量血管生成反應(yīng)，具備介導(dǎo)癌細(xì)胞進(jìn)入與微血管壁相鄰的不同位置的能力，即腫瘤細(xì)胞跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移，同時(shí)模型能產(chǎn)生和維持生長因子和引誘劑的空間濃度梯度。然而，該模型仍然有缺陷，即血管出芽起源于沒有細(xì)胞-細(xì)胞連接的內(nèi)皮細(xì)胞簇，而不是先前存在的血管，這與體內(nèi)病理狀態(tài)下，腫瘤血管生成出芽起源于癌群附近完全血管有所差異。

所以綜合起來微流控腫瘤-血管生成模型仍然存在一系列亟待解決的問題：①從微流控獲得的結(jié)果與臨床腫瘤組織間情況的關(guān)聯(lián)性問題[29]；②對體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的還原度問題；③模型的穩(wěn)定性和可重復(fù)性問題。針對該缺點(diǎn)，都需要進(jìn)一步深入探索研究來使模型更加完善。

4 結(jié)論與展望

現(xiàn)今腫瘤血管生成體外模型的不斷地被人們應(yīng)用于腫瘤血管的研究，隨著人們對腫瘤血管的認(rèn)識(shí)逐漸深入，多種的血管生成方式為人們所熟知。這也為腫瘤血管體外模型的構(gòu)建提供更多的方向，而微流控技術(shù)憑借其各項(xiàng)優(yōu)勢為腫瘤血管生成體外模型的研究提供很好的研究前景，雖然目前還有一些需要大家繼續(xù)探索解決的問題，但是整體上該技術(shù)的先進(jìn)性有效性是毋庸置疑的，期待該技術(shù)在不久的將來大放異彩。

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