豬細(xì)小病毒的分離與鑒定

王 璇，吳玙彤，潘淑惠，文正常

（貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005）

豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV)）是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一。Cartwright等1967年首次證實(shí)了它的致病性[1]。我國候世寬、潘雪珠等分別在黑龍江、上海、四川等地分離出PPV，證明本病在我國存在[2-5]。近年來，由于豬只流通頻繁，北京、廣西、寧夏及周邊地區(qū)、河南等地都有豬細(xì)小病毒感染報道。

2016年9月，貴州某豬場的139頭初產(chǎn)母豬開始產(chǎn)仔，所產(chǎn)的仔豬中有60%發(fā)生木乃伊化，30%系死胎。2016年10月，又有28頭初產(chǎn)母豬產(chǎn)仔，除去部分木乃伊和死胎以外，共產(chǎn)下274頭弱仔，大多數(shù)弱仔在產(chǎn)后2～3周內(nèi)死亡，僅34頭仔豬存活，存活率只有12．41%。筆者等根據(jù)病毒的分離與鑒定，確診為豬細(xì)小病毒感染所致，現(xiàn)將實(shí)驗室診斷過程報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

3頭流產(chǎn)胎兒，采集自貴州某豬場。

1.1.2 細(xì)胞

PK-15傳代細(xì)胞，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 試劑

SDS、蛋白酶K、酚/氯仿/異戊 醇、dNTPs、Taq DNA聚 合 酶、D2000 DNA Marker、RNase等 試 劑，購自上海生物工程技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料處理

取種豬場B261、B262、B38初產(chǎn)母豬流產(chǎn)胎兒的肝臟病料，混合后以1∶5的比例加入生理鹽水研磨組織勻漿液，青霉素、鏈霉素雙抗處理過夜，反復(fù)凍融3次，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min除去組織碎片，取上清液作無菌檢查合格后－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒分離培養(yǎng)

采用0．25%胰酶消化分散PK-15單層細(xì)胞后，待細(xì)胞長滿細(xì)胞瓶的1/3時，貼壁傾倒瓶內(nèi)營養(yǎng)液，加入已處理好的病料9 mL。37 ℃吸附1 h（每隔15 min搖一次）后，加入等量的維持液。37 ℃培養(yǎng)3～7 d，待出現(xiàn)細(xì)胞病變后，收凍。如3～7 d后還未出現(xiàn)病變，再盲傳3代，若無病變則棄之。同時設(shè)正常對照細(xì)胞。

1.2.3 PCR鑒定

1．2．3．1 引物的設(shè)計與合成

采用Moliter等[6]報道的針對豬細(xì)小病毒VP2基因的1對引物序列，由大連寶生物工程有限公司合成。引物序列為P1：5′－GCAGTACCAATTCATCTTCT－3′；P2：5′－TGGTGTCCTTCTGTGGTAGG－3′，片段大小為158 bp。1．2．3．2 PCR 反應(yīng)

采用2 m5L 的反應(yīng)體系：10×PCR buffer（MgCl2Free）2．5 mL、MgCl（22．5 mM）2 mL、dNTP（10 mM）0．5 mL、TaqDNA 聚合酶（2．5 U/ mL ）0．5 mL、P1/P2引 物（10 pM/ mL）各1 mL、病毒DNA模板1 mL，最后用16．5 mL的滅菌雙蒸水補(bǔ)至25 mL。

在下述反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性4 min，然后進(jìn)行34個循環(huán)，95 ℃變性 45 s、55 ℃退火 30 s、72 ℃延伸45 s，最后72 ℃延伸10 min。

取PCR產(chǎn)物6mL與溴酚藍(lán)緩沖液2 mL混勻，加樣，于1．5%瓊脂糖凝膠中電泳，80 V恒壓電泳90 min，溴化乙錠染色后，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.2.4 病料的檢測

臨床樣品DNA模板的制備：將3頭流產(chǎn)胎兒（B261、B262、B38）的腎、脾、腦、肝等充分研磨后，用1：5的生理鹽水稀釋，－20 ℃反復(fù)凍融3次，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min后。按SDS-proteinaseK法提取病料核酸樣本。

2 結(jié)果

2.1 豬細(xì)小病毒的分離

從 3份 病 料 中（B261、B262、B38）分離到1株豬細(xì)小病毒，命名為貴州PPV。病毒在PK-15傳代細(xì)胞上傳代后均能出現(xiàn)細(xì)胞病變，接毒2～4 d后可明顯見到規(guī)律性的細(xì)胞病變（C PE）；細(xì)胞漿出現(xiàn)彌散性顆粒，病變細(xì)胞變圓，聚集成簇，呈現(xiàn)拉網(wǎng)狀；96～120 h，這種灶性細(xì)胞病變由疏散狀態(tài)發(fā)展為密布整個培養(yǎng)瓶；144 h以后，病變的細(xì)胞逐漸脫落、上浮。在觀察期間，正常對照細(xì)胞生長良好，未出現(xiàn)異常反應(yīng)。

2.2 病料的檢測

采用P1、P2引物對臨床上3頭流產(chǎn)胎兒的不同組織進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果在3頭流產(chǎn)胎兒的不同組織均檢測到了PPV。不同組織間并沒有明顯差異。說明PPV在流產(chǎn)胎兒體內(nèi)沒有特別的組織和器官嗜性。

3 討論

1)根據(jù)病毒的分離培養(yǎng)特性，結(jié)合PCR鑒定，可以判定病料中分離到的病原是豬細(xì)小病毒，貴州省某豬場發(fā)生的是豬細(xì)小病毒感染。

2)本次實(shí)驗利用陽性病料經(jīng)處理后在PK-15傳代細(xì)胞上培養(yǎng)，分離出了一株豬細(xì)小病毒，此病毒能夠在PK-15細(xì)胞上適應(yīng)生長并引起明顯的細(xì)胞病變。據(jù)文獻(xiàn)報道，PPV的增殖必須依賴細(xì)胞的生長周期，因此要獲得大量的病毒并出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，PPV接種的時機(jī)非常關(guān)鍵，要求在多數(shù)細(xì)胞處于旺盛的細(xì)胞有絲分裂期進(jìn)行病毒接種，而不像一般常規(guī)那樣，待細(xì)胞形成單層后才能接種。因此，待細(xì)胞長滿細(xì)胞瓶的1/3時接種為佳。

3)Moliter等根據(jù)PPV基因組序列設(shè)計了擴(kuò)增VP2基因中158 bp片段的1對引物，成功地建立了PPV的PCR檢測方法。但是該方法有一個明顯的不足之處，由于擴(kuò)增的片段只有158 bp，在檢測臨床樣本時，該擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和PCR反應(yīng)中經(jīng)常出現(xiàn)非特異引物二聚體相近，極易造成結(jié)果的誤判。

4)本實(shí)驗用PCR方法對3頭流產(chǎn)胎兒的不同組織進(jìn)行檢測，在3頭胎兒的不同臟器均可檢測到PPV。不同組織間并未見明顯的差異，說明PPV在流產(chǎn)胎兒體內(nèi)沒有特別的組織和器官嗜性，檢測的結(jié)果和文獻(xiàn)報道檢測的結(jié)果一致。

[1] C A R T W R I G H T F，H U C K R A． Viruses isolated in association with herd， inifertility， abrotions and stillbirths in pigs[J]．Vet．Rec，1967，61：196-197．

[2] 侯世寬，江曙光，孫恩貴，等．豬細(xì)小病毒Mu--1株的分離和鑒定[J]．獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報 ， 1983，3(4)：321-328．

[3] 潘雪珠，劉洪云，嚴(yán)仲烈，等．豬細(xì)小病毒S--1毒株的分離和鑒定[J]．上海畜牧獸醫(yī)通訊 ，1983(1)：1-3．

[4] 潘雪珠，嚴(yán)仲烈， 唐騏駿，等．豬細(xì)小病毒S--1毒株的分離和鑒定(二)[J]．上海南牧獸醫(yī)通訊，1984(1)：5-8．

[5] 鄔捷，曹國文，喬代蓉，等．秋季初產(chǎn)母豬死胎病毒病原的分離和鑒定[J]．西南農(nóng)業(yè)學(xué)報 ，1985(2)：63-69．

[6] MOLITOR T W，ORAVCCRAKUL K，HANG Q，et al． Polymorase chain reaction(PCR) aplification for the detcction of porcine parvovirus[J]．J VirolMcthods，1991，32(2-3)：201-211．