中國傳統(tǒng)豆制品中異黃酮的超高效液相色譜-紫外檢測器快速定量法

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(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)食品安全國際合作聯(lián)合實驗室,江蘇無錫 214122;3.瑪氏食品(中國)有限公司，北京 101407)

大豆異黃酮是大豆生長過程中形成的次級代謝產(chǎn)物,具有調(diào)節(jié)體內(nèi)激素水平、蛋白質(zhì)合成、生長因子活性、代謝生物學(xué)活性等生理功能[1-3]。亞洲,尤其是中國,大豆制品是人民日常膳食的重要組成。中國是大豆的故鄉(xiāng)，我國人民利用大豆研制了種類豐富的豆制品，如素雞、豆腐、豆?jié){、百葉等，其中大部分豆制品為中國獨有的特色食品。隨著健康意識的提升,2010-2012年間調(diào)查顯示,我國每人每天居民豆類及豆制品的攝入量約為10.9 g,但遠(yuǎn)沒有達(dá)到我國平衡膳食寶塔建議(30～50 g),這說明豆制品未來在我國市場仍具有巨大的發(fā)展?jié)摿4]。因此,對我國傳統(tǒng)豆制品中大豆異黃酮的定性定量方法學(xué)研究,對豆制品工業(yè)生產(chǎn)工藝的提高、產(chǎn)品的質(zhì)量控制及營養(yǎng)評估均有重要意義。

自然界中的大豆異黃酮主要以游離型的苷元和結(jié)合型的糖苷兩種形式存在,主要包括三種苷元(大豆苷、大豆苷元、染料木素),苷元的三種7-O-葡萄糖苷,三種6″-O-丙二酰葡萄糖苷和三種6″-O-乙?；咸烟擒?共12種結(jié)構(gòu)[5]。已報道的異黃酮定量分析包括紫外分光光度法、三波長法、高效液相法(HPLC)、超高效液相色譜法(UHPLC)、液相色譜質(zhì)譜法(LC MS)等[6-9]。其中,LC-MS除定量外,還可對未知異黃酮成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測,但由于價格昂貴,不為實驗室廣泛配備[10-13]。HPLC具有準(zhǔn)確、快速、靈敏度高等優(yōu)勢,已被各單位廣泛配置[6,8,14],因此,目前以HPLC法為主對進(jìn)行異黃酮定量,分析時間一般為20～40 min之間[6,8,14]。在基于HPLC的分析中,由于丙二?；?、乙?；钠咸烟擒沾蠖巩慄S酮極性相近,需要通過長時間的梯度洗脫來實現(xiàn)分離[6,8,14]。UPLC是在傳統(tǒng)HPLC的制造技術(shù)、擴(kuò)散條件和耐受壓力進(jìn)行了優(yōu)化，耐壓達(dá)到15000 psi上，匹配小于2 μm顆粒度色譜柱，柱外擴(kuò)散體積小于15 μL，從而使分析速度、分離效率、分析靈敏度顯著提高[15-16]。然而,在實際應(yīng)用中,由于丙二?；鸵阴；钠咸烟擒沾蠖巩慄S酮標(biāo)準(zhǔn)樣品價格昂貴且不穩(wěn)定,在實際生產(chǎn)質(zhì)控中難以實現(xiàn)對6種丙二酰和乙?；拇蠖巩慄S酮進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品直接定量。同時,豆制品加工過程,尤其是熱處理過程會促使丙二酰基和乙?；揎椀钠咸烟擒盏慕到?也可能導(dǎo)致對葡萄糖配基的進(jìn)一步修飾,從而使豆制品中大豆異黃酮的組成更為復(fù)雜[13,17-18]。這意味著即使對12種大豆異黃酮同時進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品定量也仍有一部分未知異黃酮修飾物含量無法評估。為了更為準(zhǔn)確的評估豆制品中大豆異黃酮的含量,利用酸性條件將大豆異黃酮衍生物上葡萄糖配基上的修飾基團(tuán)去除,使丙二酰化、乙酰化及其他葡萄糖配基修飾的衍生物均轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的葡萄糖苷,從而將豆制品中可能存在的12種以上異黃酮物質(zhì)降低為6種標(biāo)準(zhǔn)品易得價格相對低廉的三種葡萄糖苷和三種苷元。

本文以中國傳統(tǒng)豆制品豆干、素雞、素百葉、腐竹、內(nèi)酯豆腐、嫩豆腐和老豆腐為研究對象，利用酸化提取，建立基于超高效液相色譜-紫外檢測器(UPLC-UV)中的大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

大豆苷(daidzin,DAI-G,純度≥98%)、黃豆黃苷(glycitin,純度≥98%)、染料木苷(genistin,純度≥98%)、大豆苷元(daidzein,純度≥98%)、黃豆黃素(glycitein,純度≥98%)、染料木素(genistein,純度≥98%) 上海士鋒生物科技有限公司;色譜純甲醇 美國天地試劑公司;鹽酸 國藥集團(tuán)化學(xué)股份有限公司;超純水(18.2 MΩ);豆干、素雞、素百葉、腐竹、內(nèi)酯豆腐、嫩豆腐和老豆腐 購于本地華潤萬家超市；乙腈、甲醇、甲酸 色譜純(TEDIA，USA)；實驗用水 Milli-Q超純水；標(biāo)準(zhǔn)儲備液 準(zhǔn)確稱取各上述標(biāo)準(zhǔn)品加至50 mL容量瓶中，均用乙腈溶解并稀釋至標(biāo)線，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，4 ℃冷藏保存。

Acquity UPLC超高效液相色譜儀 美國沃特世公司;Acquity UPLC二極管陣列紫外檢測器 美國沃特世公司;Masslynx 4.1工作站 美國沃特世公司;Kinetex-C18超高效液相色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm) 美國沃特世公司；SB-3200D超聲清洗劑 寧波新芝生物公司。

1.2實驗方法

1.2.1 色譜條件 流動相為乙腈和0.1%甲酸。流動梯度洗脫程序:0～0.5 min,10%乙腈;0.5～10 min,10%～45%乙腈;10～12 min,45%～100%乙腈,流速:0.3 mL/min,柱溫:45 ℃,紫外檢測波長260 nm;進(jìn)樣量1 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液分別逐級稀釋，配成濃度分別為0.05、0.1、0.3、0.5、1、5、10、25、50、75、100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.2.1分析條件下檢測各組分含量。

1.2.3 大豆異黃酮提取 酸化提取方法根據(jù)José L. Pealvo等[8]建立的方法,并稍加改進(jìn)。利用天平準(zhǔn)確稱取0.10 g固體樣品,溶于10 mL酸化的80%甲醇水提取液(1 mol·L-1HCl),均質(zhì)5 min,超聲提取5 min,80 ℃下水浴加熱1 h。取上清100 μL,甲醇稀釋10倍后,10000 r/min離心3 min,過0.22 μm濾膜后待測。

2 結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化

本實驗中,采用梯度洗脫,有利于提高分離效率,同時有效縮短分析時間。如圖1所示,本實驗中采用乙腈和0.1%甲酸(V/V)在8 min內(nèi)實現(xiàn)6種大豆異黃酮的基線分離。洗脫峰依次為:大豆苷(3.25 min),黃豆黃苷(3.42 min),染料木苷(4.29 min),大豆黃素(6.03 min),黃豆黃素(6.37 min),染料木素(7.70 min)。在豆制品中,含有極性較強(qiáng)且在260 nm檢測波長下具有紫外吸收的嘌呤堿類化合物[15-17],因此在梯度洗脫起始階段設(shè)計了0.5 min的10%乙腈等梯度洗脫階段,使該類化合物在被測物前從色譜柱中洗脫,從而保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,優(yōu)化色譜峰峰型，避免由于失流出等對大豆異黃酮定量結(jié)果產(chǎn)生干擾。

圖1 6種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖.Fig.1 The UPLC chromatogram of six standards of Isoflaovnes

2.2線性范圍、檢出限及精密度

利用梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品混合液進(jìn)樣,以1.2.1中色譜條件檢測,以大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素6種標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),260 nm檢測波長下測得的色譜峰積分峰面積為縱坐標(biāo),建立了6種大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷的線性范圍確定為0.3～100 mg/L，大豆苷元和黃豆黃素的線性范圍確定為0.15～50 mg/L，染料木素的線性范圍確定為0.15～250 mg/L。同時通過稀釋法，以信噪比等于3為檢出限，確定了6種大豆異黃酮的檢出限。其中，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、染料木素的檢出限為0.1 mg/L，黃豆黃素的檢出限為0.08 mg/L，大豆苷元的檢出限為0.05 g/L。

表1 線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 1 Linear equations,correlation coefficients and limits of detection

2.3樣品處理與回收率

本實驗采取一步提取法對豆制品中大豆異黃酮進(jìn)行提取。將提取液中甲醇比例控制在80%,目的為沉淀蛋白,同時防止脂類等非極性雜質(zhì)的共溶出[18]。加入1 mol·L-1HCl，使樣品中大豆異黃酮修飾物水解，葡萄糖苷配基上的丙二酰和乙?；妊苌鶊F(tuán)解離，生成對應(yīng)的大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷等三種糖苷型大豆異黃酮[8]，使最終的檢測對象為3種葡萄糖苷和3種異黃酮苷元。為考察方法準(zhǔn)確性,以豆腐為對象,設(shè)計了3個質(zhì)量濃度水平的添加收回實驗(n=3)。結(jié)果見表2,三個添加水平(0.5, 5, 20 mg/kg)的大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷回收率在96.5%～99.8%之間，三個添加水平(0.1, 1, 5 mg/kg)的大豆苷元、黃豆黃素、染料木素回收率在96.7%～102.3%之間，達(dá)到分析測試要求。

表2 豆腐中6種大豆異黃酮的添加回收率Table 2 Recovery rates of six isoflavones in Soymilk and Tofu

2.4豆制品中6種大豆異黃酮的測定

在市場中購買了我國消費者日常生活中最常購買的7種大豆制品,具體為腐竹、豆干、素百葉、素雞、嫩豆腐、老豆腐和內(nèi)酯豆腐,按1.2方法進(jìn)行樣品前處理和色譜檢測。7種豆制品樣品出峰如圖2所示，可知本方法可以對6種大豆異黃酮組分實現(xiàn)有效分離，同時可保證6種被測物與其他色譜峰實現(xiàn)基線分離，從而避免對定量結(jié)果造成干擾。利用表1中標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算6種大豆異黃酮含量,結(jié)果見表3。7種豆制品中總大豆異黃酮的含量分別為，內(nèi)酯豆腐9.76 g/kg，硬豆腐13.8 g/kg，軟豆腐8.67 g/kg，素百葉14.22 g/kg，豆干16.14 g/kg，素雞16.48 g/kg，腐竹25.83 g/kg。7種豆制品隨機(jī)購于市場中，但6種大豆異黃酮中均以大豆苷和染料木苷為主要成分，二者含量在總大豆異黃酮含量占比為88.0%～93.4%，這與大豆原料本身的異黃酮組成一致[13,18]。結(jié)果表明,本研究建立的UPLC法可有效降低雜質(zhì)干擾,色譜基線穩(wěn)定且峰型良好,在10 min內(nèi)實現(xiàn)對6種大豆異黃酮的快速定量檢測,可良好應(yīng)用于常見市售豆制品的營養(yǎng)評估與質(zhì)量控制。

表3 豆制品中6種大豆異黃酮的檢測(n=3)Table 3 The analysis of six isoflavones in soybean products

圖2 260 nm下的不同豆制品中大豆異黃酮的UPLC色譜圖Fig.2 The UPLC chromatograms of isoflavones in different soy foods at 260 nm

3 結(jié)論

本方法在酸性條件下，將豆制品中主要的大豆異黃酮修飾物水解，使其葡萄糖苷配基上的丙二酰和乙?；妊苌鶊F(tuán)解離，生成對應(yīng)的糖苷型大豆異黃酮，從而將豆制品中可能存在的12種以上異黃酮物質(zhì)降低為6種標(biāo)準(zhǔn)品易得價格相對低廉的三種葡萄糖苷和三種苷元。色譜分析采用乙腈和0.1%甲酸(V/V)梯度洗脫，在8 min內(nèi)實現(xiàn)6種大豆異黃酮的基線分離，并在梯度洗脫起始階段設(shè)計了0.5 min的10%乙腈等度洗脫以排除嘌呤堿類化合物對檢測的干擾。建立了6種大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，其中大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷的線性范圍為0.3～100 mg/L，大豆苷元和黃豆黃素的線性范圍為0.15～50 mg/L，染料木素的線性范圍為0.15～250 mg/L。三個添加水平(0.5,5,20 mg/kg)的大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷回收率在96.5%～99.8%之間，三個添加水平(0.1,1,5 mg/kg)的大豆苷元、黃豆黃素、染料木素回收率在96.7%～102.3%之間，達(dá)到分析測試要求。利用本方法對腐竹、豆干、素百葉、素雞、嫩豆腐、老豆腐和內(nèi)酯豆腐等7種我國傳統(tǒng)豆制品中的大豆異黃酮進(jìn)行了定性定量分析，總大豆異黃酮含量在8.67～25.83 g/kg間。不同豆制品間均以6種大豆異黃酮中大豆苷和染料木苷為主要成分，占88.0%～93.4%。結(jié)果表明，本研究建立的UPLC法可有效降低雜質(zhì)干擾，色譜基線穩(wěn)定且峰型良好，在10 min內(nèi)實現(xiàn)對6種大豆異黃酮的快速定量檢測，可良好應(yīng)用于常見市售豆制品的營養(yǎng)評估與質(zhì)量控制。

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