超聲輔助提取灰灰菜多糖工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性

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(商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院,陜西商洛 726000)

灰灰菜(ChenopodiumalbumLinn)為藜科藜屬一年生草本植物,遍布世界各地。全草皆可入藥,性味甘平,具有清熱利濕[1]、降壓、保肝[2-3]、抑菌[4-6]和調(diào)節(jié)免疫功能[1]等諸多藥理活性。國內(nèi)外研究表明,食用灰灰菜能夠預(yù)防貧血,促進青少年兒童的生長發(fā)育[7]。研究發(fā)現(xiàn)灰灰菜嫩葉中富含維生素、胡蘿卜素和膳食纖維等營養(yǎng)成分以及多種無機鹽[8-9]。此外,灰灰菜中碳水化合物的含量高達(dá)6.0%[8]。Cutillo等研究表明灰灰菜中主要含多酚類和木質(zhì)素類成分[10]。有研究人員對灰灰菜中總黃酮[9]和葉黃素[11]展開了相關(guān)研究,但對灰灰菜中多糖的研究則鮮有報道。

目前,超聲輔助提取技術(shù)在天然多糖類成分提取過程中的優(yōu)勢日益凸顯[12],不僅可以大大縮短傳統(tǒng)的水提醇沉法的時間,而且在一定程度上能夠提高多糖得率[12-13]。此外,有研究表明,響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝比正交設(shè)計優(yōu)化的條件更為全面,更能直觀地反映各因素的交互作用[14-15]。本文以液料比、超聲時間、超聲溫度、超聲功率、乙醇濃度為考察因素,多糖得率為響應(yīng)因子,采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助水提醇沉法制備灰灰菜多糖提取工藝;進一步采用DPPH法、ABTS法和鄰二氮菲-Fe2+法測定其體外抗氧化活性,為灰灰菜多糖高效提取及其抗氧化劑開發(fā)提供理論依據(jù),進而為以灰灰菜為原料的保健食品研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

灰灰菜 2016年4～5月采自陜西省商洛市洛南縣古城鎮(zhèn)中山村,經(jīng)鑒定為藜科藜屬一年生草本植物灰灰菜的新鮮嫩葉;1.1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 購于Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA);硫酸亞鐵銨、鄰二氮菲、檸檬酸、檸檬酸鈉 均為國產(chǎn)分析純，購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

755B紫外-可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;BILON-1000CT超聲波提取器 上海比朗儀器制造有限公司;FA1104電子天平 上海精科天平廠;LGJ-10冷凍干燥機 鄭州明天儀器設(shè)備有限公司;TGL-20bR高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;RE-3000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1 灰灰菜粗多糖(CAPs)的制備及含量測定 制備流程:灰灰菜→粉碎(過60目篩)→超聲輔助熱水浸提→離心(4000 r/min)→取上清液(沉淀加水重復(fù)提取兩次,合并三次上清液)→濃縮(100～200 mL為宜)→乙醇沉淀→離心(4000 r/min,重復(fù)兩次)→沉淀加適量蒸餾水溶解→Sevage法除蛋白→透析→真空冷凍干燥→灰灰菜粗多糖。

1.2.2 CAPs制備的單因素實驗 以水作為提取溶劑、多糖得率為考察指標(biāo),按1.2.1流程提取CAPs。

1.2.2.1 液料比對多糖得率的影響 固定超聲時間為20 min、超聲溫度為70 ℃、超聲功率為400 W、乙醇濃度為90%,考察提取溶劑水和材料的比例(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1)對多糖得率的影響。

1.2.2.2 超聲時間的影響 在液料比20∶1、超聲溫度70 ℃、超聲功率400 W、乙醇濃度90%條件下,考察超聲時間(5、10、15、20、25和30 min)對多糖得率的影響。

1.2.2.3 超聲溫度的影響 固定液料比20∶1、超聲時間20 min、超聲功率400 W、乙醇濃度90%,考察超聲溫度(40、50、60、70、80和90 ℃)對多糖得率的影響。

1.2.2.4 超聲功率的影響 以20∶1的液料比、超聲時間20 min、超聲溫度70 ℃、90%的乙醇為固定條件,考察超聲波功率(100、200、300、400、500和600 W)對多糖得率的影響。

1.2.2.5 醇沉?xí)r乙醇濃度的影響 最后在液料比20∶1、超聲時間20 min、超聲溫度70 ℃、超聲功率400 W的條件下,考察乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%和100%)對多糖得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化CAPs提取條件 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選擇液料比、超聲時間、超聲溫度、超聲功率和乙醇濃度作為自變量,依據(jù)Box-Behnken設(shè)計,進行五因素三水平的工藝優(yōu)化實驗,以CAPs得率為響應(yīng)值,利用Design Expert 8.05b軟件對結(jié)果進行分析,因素水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面因子設(shè)計及水平表Table 1 Factors and levels in RSM design

1.2.4 多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法進行[16]。CAPs得率(%)=M粗多糖/M灰灰菜粉末×100

1.2.5 灰灰菜多糖體外抗氧化活性 以維生素C(Vit. C)為陽性對照,CAPs對DPPH自由基和ABTS自由基的清除活性測定方法參照文獻[16-17],對·OH自由基的清除能力采用鄰二氮菲-Fe2+法測定[18]。

1.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

實驗方案設(shè)計和模型構(gòu)建采用Design Expert 8.05b軟件,數(shù)據(jù)處理采用Excel進行,統(tǒng)計分析采用SPSS 18.0軟件中的單因素ANOVA進行。

2 結(jié)果與分析

2.1CAPs制備工藝單因素實驗結(jié)果

2.1.1 液料比對CAPs得率的影響 從圖1中可以看出,液料比對多糖得率的影響呈現(xiàn)持續(xù)遞增的趨勢,在液料比為5∶1到15∶1之間,多糖得率幾乎呈直線遞增,而后增幅有所放緩,曲線沒有極值點,在實驗范圍內(nèi)曲線最大值為5.02%,此時的液料比為30∶1,說明液料比愈大愈能充分將有效成分提取出來,這一點與和法濤等的研究結(jié)果一致[19]。這是因為水作為溶劑,從灰灰菜中提取多糖的過程實質(zhì)上是材料中的多糖分子不斷向溶劑中擴散的過程,隨著溶劑量的不斷加大,多糖分子不斷被溶出,逐漸達(dá)到某一平衡狀態(tài)。即在20∶1附近溶劑和材料達(dá)到平衡狀態(tài),基于此,后續(xù)實驗選取液料比20∶1。

圖1 液料比對多糖得率的影響Fig.1 Effects of water-material ratio on the yield of polysaccharides

2.1.2 超聲時間對CAPs得率的影響 由圖2可以看出,在前5～20 min內(nèi),CAPs得率快速增加達(dá)到峰值4.6%,而后逐漸下降。這是因為剛開始時溶劑中多糖含量較低,而原材料中的多糖含量高,多糖成分由原料內(nèi)部向周圍溶劑中擴散的動能較強,故隨著超聲時間的增加,多糖得率逐漸增大,達(dá)到峰值。但是在20 min后,延長超聲時間多糖得率反而降低,這可能是由于隨著時間的延長多糖物質(zhì)逐漸分解的緣故。

圖2 超聲時間對多糖得率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time on the yield of polysaccharides

2.1.3 超聲溫度對CAPs得率的影響 從圖3中可以看出,在40～70 ℃,CAPs得率快速增加達(dá)到峰值,而后快速下降。這是因為剛開始加熱時由于受分子熱運動的影響,灰灰菜當(dāng)中的多糖類成分浸出率逐漸增大,CAPs得率隨著溫度的增加而增加,在70 ℃是達(dá)到峰值。此后,隨著溫度的繼續(xù)升高,導(dǎo)致多糖遇高溫分解,進而出現(xiàn)多糖得率下降的現(xiàn)象。

圖3 超聲溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic temperature on the yield of polysaccharides

2.1.4 超聲功率對CAPs得率的影響 由圖4可知,超聲功率對CAPs得率的影響呈現(xiàn)先快速增加后緩慢減小的趨勢,尤其是在300～400 W,多糖得率最高。這是因為超聲波具有機械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng),通過增大多糖分子的運動速度和溶劑的穿透力以提取出更多的多糖類成分,而這一作用受超聲功率影響非常明顯,功率過小不足以充分發(fā)揮超聲波的作用,功率過大容易造成多糖分解。

圖4 超聲功率對多糖得率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic power on the yield of polysaccharides

2.1.5 乙醇濃度對CAPs得率的影響 從圖5可知,乙醇沉淀時乙醇濃度對CAPs得率的影響呈現(xiàn)先快速增加后趨于平緩直至減小的趨勢,乙醇濃度對多糖得率影響的峰值為5.11%,出現(xiàn)在乙醇濃度為90%的實驗點。這是因為多糖類物質(zhì)具有溶解于稀乙醇溶液不溶于高濃度的乙醇溶液的特性,故而利用這一性質(zhì)對提取的粗多糖進行純化。

圖5 乙醇濃度對多糖得率的影響Fig.5 Effects of ethanol concentration of the yield of polysaccharides

2.2響應(yīng)面優(yōu)化CAPs提取條件

2.2.1 Box-Behnken設(shè)計與實驗結(jié)果 基于上述單因素實驗結(jié)果,綜合考慮各因素對多糖得率影響趨勢,按照選定的因素水平表(表1)進行上述五個因素(液料比、超聲時間、超聲溫度、超聲功率和乙醇濃度)與CAPs得率之間的五因素三水平響應(yīng)面實驗,根據(jù)Design Expert 8.05b軟件中的Box-Behnken實驗設(shè)計原理,共安排46組實驗,實驗方案及結(jié)果如表2所示。

表2 灰灰菜多糖響應(yīng)面的實驗方案及結(jié)果Table 2 Results and experimental design of RSM on CAPs of Chenopodium album L.

利用Design Expert 8.05b軟件程序?qū)Ρ?中的實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析,對各因素回歸擬合后,得到CAPs得率(Y)對液料比(A)、超聲時間(B)、超聲溫度(C)、超聲功率(D)和乙醇濃度(E)的五元二次回歸方程:

Y=6.53572-0.02896A-7.12×10-3B-0.06384C+4.67×10-3D-0.05598E+6.5×10-4AB+2.5×10-4AC+2.75×10-5AD+1.67×10-5AE+1.33×10-4BC-4.5×10-5BD+2.33×10-4BE+4.5×10-5CD+3.0×10-4CE-5.0×10-6DE-4.0×10-5A2-4.6×10-4B2+1.5×10-4C2-7.7×10-6D2+3.6×10-4E2。

表3 灰灰菜多糖回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis with quadratic model of RSM on CAPs of Chenopodium album L.

從表3中可以看出,乙醇濃度對多糖得率的影響高度顯著,而超聲時間對多糖得率影響不顯著,其余因素對多糖得率影響均為極顯著。各因素交互作用對實驗指標(biāo)影響情況如下:超聲溫度與乙醇濃度交互作用對多糖得率影響顯著,其余各交互項均不顯著，其中液料比與超聲時間(AB)、液料比與超聲溫度(AC)和超聲溫度與超聲功率(CD)三個交互作用較大;超聲功率和乙醇濃度二次項對多糖得率影響顯著,其余均不顯著。

注:** 表示p<0.01,差異極顯著;* 表示p<0.05,差異顯著。

2.2.2 響應(yīng)面分析圖 依據(jù)回歸方程和Design-Expert 8.05b軟件繪制出不同因素的響應(yīng)面分析圖,結(jié)果如圖6所示。從響應(yīng)面分析圖上可以較直觀地看出影響多糖得率各參數(shù)之間的交互作用。

從圖6中可以看出,超聲溫度(C)與乙醇濃度(E)交互作用對多糖得率影響顯著,AB、AC和CD三個交互作用較大，其余均不顯著(不顯著交互作用響應(yīng)面圖未列出)。交互作用不顯著的原因可能是因素的主效應(yīng)在起作用。曲線走勢越陡峭,表明該因素對多糖的得率影響越大;曲線走勢越平緩說明該因素對多糖得率影響較小[13-15]。研究結(jié)果表明,對CAPs得率影響最大的是多糖提取液醇沉?xí)r的乙醇濃度,其次是超聲時的功率和溫度,表3中回歸分析結(jié)果也與此相吻合,乙醇濃度對CAPs得率影響達(dá)到極顯著水平(p<0.01),液料比、超聲功率和超聲溫度三者對應(yīng)的p值均小于0.01,達(dá)到了極顯著水平。

2.2.3 最佳工藝參數(shù)確定及驗證實驗 利用Design-Expert 8.05b軟件進行工藝優(yōu)化處理,得到CAPs最佳提取工藝:液料比29.87∶1,超聲時間19.53 min,超聲溫度80 ℃,超聲功率463.91 W,乙醇濃度99.98%,在該條件下,灰灰菜多糖得率可達(dá)最大值5.172%。結(jié)合生產(chǎn)實踐和便于實際操作將各因素取值修正為:液料比30∶1,超聲時間20 min,超聲溫度80 ℃,超聲功率460 W,乙醇濃度100%,在此條件下進行六次平行實驗,得出CAPs平均得率為5.153%(純度為82.36%),非常接近模型預(yù)測值,說明模型可靠。

2.3CAPs的體外抗氧化活性研究

圖6 各因素交互影響多糖得率的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot for the mutual effects of five variables on yield of CAPs

2.3.1 CAPs對DPPH自由基的清除作用 從圖7中可以看出,CAPs對DPPH自由基的清除作用呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系,且隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)上升趨勢,其半數(shù)抑制濃度(IC50)為1.899 mg/mL。當(dāng)濃度從1.0 mg/mL增加到3.0 mg/mL時,CAPs對DPPH自由基的清除率增長較快,而后隨著濃度的增加增速有所放緩。當(dāng)濃度達(dá)到4.0 mg/mL時,CAPs對DPPH清除率達(dá)到87.4%,接近同濃度的陽性對照。

圖7 CAPs對DPPH自由基的清除率Fig.7 Activities of CAPs scavenging DPPH radical

2.3.2 CAPs對ABTS自由基的清除作用 由圖8可知,隨著CAPs濃度的不斷增加,其對ABTS自由基的清除率呈現(xiàn)不斷上升趨勢,其IC50為1.973 mg/mL。當(dāng)濃度從1.0 mg/mL增加到2.5 mg/mL時,CAPs對ABTS·的清除率幾乎呈線性遞增,此后增加趨勢放緩。當(dāng)濃度為4.0 mg/mL時,CAPs對ABTS·清除率達(dá)到最大為89.9%。此外,從圖中可以看出,與相同濃度的陽性對照相比,CAPs對ABTS自由基的清除能力稍低,尤其是在多糖樣品濃度較低的情況下,這種差異較明顯,這可能是多糖純度不夠高的緣故。

圖8 CAPs對ABTS自由基的清除率Fig.8 Activities of CAPs scavenging ABTS radical

圖9 CAPs對羥基自由基的清除率Fig.9 Activities of CAPs scavenging hydroxyl radical

2.3.3 CAPs對羥基自由基的清除作用 從圖9中可以看出,CAPs和陽性對照維生素C(Vit.C)對羥基自由基的清除率均隨著樣品濃度的不斷增大呈逐漸上升的趨勢,尤其是當(dāng)多糖樣品濃度從1.5 mg/mL開始,幾乎呈現(xiàn)線性遞增;而Vit.C的清除率則較高,尤其是當(dāng)濃度超過1.5 mg/mL時,清除率均在90.0%以上。當(dāng)樣品濃度從0.5 mg/mL增加到4.0 mg/mL時,CAPs對羥基自由基的清除率由5.97%逐漸提高至79.43%,其半數(shù)抑制濃度(IC50)為2.827 mg/mL。相比對DPPH·和ABTS·的清除能力,CAPs對羥基自由基的清除能力要差一些。

此外,從圖7～圖9中可以看出,CAPs對DPPH·和ABTS·的清除活性要強于羥基自由基,這一點通過三者的IC50值也可以得到證實?？傮w而言,CAPs對DPPH·、ABTS·和·OH均有較好的清除活性,并且呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

3 結(jié)論

探明了超聲輔助熱水浸提-乙醇沉淀法提取灰灰菜粗多糖最佳工藝,液料比30∶1,超聲時間

20 min,超聲溫度80 ℃,超聲功率460 W,乙醇濃度100%,在此條件下多糖得率為5.153%(純度為82.36%)。

CAPs對DPPH·、ABTS·和·OH均有較強的清除能力,其半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為1.899、1.973和2.827 mg/mL。當(dāng)濃度為4.0 mg/mL時,CAPs對DPPH·、ABTS·和·OH的清除率分別為89.9%、87.4%和79.3%,說明CAPs具有較好的體外抗氧化活性。

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