紅樹林植物闊苞菊內(nèi)生真菌硒富集工藝優(yōu)化

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(1.欽州學(xué)院海洋學(xué)院,廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西欽州 535000；2.欽州學(xué)院石油與化工學(xué)院,廣西高校北部灣石油天然氣資源有效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西欽州 535000)

硒是植物、動(dòng)物包括人類必需的微量營養(yǎng)元素,是硒代半光谷氨酸(Sec)和含硒過氧化物酶,如谷胱甘肽過氧化物酶GPx等的重要成分,具有提高人體免疫力、抗氧化、抗腫瘤、拮抗重金屬、延緩衰老、保護(hù)心肌和肝臟健康和提高生殖機(jī)能等多種功效[1]。缺硒是導(dǎo)致大骨節(jié)病、克山病、糖尿病等一系列疾病的重要原因[2-3]。因此,科學(xué)補(bǔ)硒已成為當(dāng)前人們防止疾病、增進(jìn)健康和延緩衰老的重要舉措之一[4-5]。研究表明,有機(jī)硒不僅毒性低,與無機(jī)硒相比,攝入有機(jī)硒對(duì)提高實(shí)驗(yàn)大鼠組織中GSH-Px(肝臟:有機(jī)硒組/無機(jī)硒組:265.13±8.62/250.39±6.32 U/mg pro)、SOD(心臟:有機(jī)硒組/無機(jī)硒組:96.16±1.42/93.30±4.01 U/mg pro)、GSH(腎臟:有機(jī)硒組/無機(jī)硒組:34.65±1.06/30.18±1.44 U/mg pro)活力水平更為顯著[6]。由于微生物具有繁殖快、適應(yīng)力強(qiáng)、代謝產(chǎn)物豐富等優(yōu)勢。因此,微生物轉(zhuǎn)化無機(jī)硒獲得安全有效的有機(jī)硒源,成為了開展研究的焦點(diǎn)[7-9]。

海洋是世界上公認(rèn)的最大的微生物生存的寶庫,利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)活性有機(jī)硒物質(zhì),不但周期短,而且可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng),也是豐富有機(jī)硒的來源的有效途徑[10-11]。但是,同時(shí)也面臨著菌體硒的耐受能力差異大、有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率低等一些問題。因此,對(duì)富硒地區(qū)的微生物的硒富集能力進(jìn)行篩選、馴化以及發(fā)酵工藝優(yōu)化,才能有望獲得富硒能力強(qiáng)的菌株。

本文采用單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)廣西北部灣富硒地區(qū)[12]半生紅樹林植物闊苞菊內(nèi)生真菌的硒耐受能力、生長條件及硒富集能力進(jìn)行了初步的研究,旨在探索闊苞菊內(nèi)生真菌富集硒的最優(yōu)化條件,篩選馴化富硒菌種。并為進(jìn)一步開發(fā)海洋植物內(nèi)生富硒真菌以及其有機(jī)硒的代謝產(chǎn)物在食品、醫(yī)藥應(yīng)用等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

本研究菌種為實(shí)驗(yàn)室保藏的一株自闊苞菊葉片中純化分離得到綠色真菌,闊苞菊采樣地點(diǎn)為廣西欽州市茅尾海;硒粉(分析純) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；高氯酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%,優(yōu)級(jí)純) 天津市鑫源化工有限公司;濃硝酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%,優(yōu)級(jí)純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;碘化鉀 天津大茂化學(xué)試劑廠;阿拉伯樹膠 山東西亞化學(xué)股份有限公司;葡萄糖(分析純)、乳糖(分析純)、蔗糖(分析純) 天津市福晨化學(xué)試劑廠;麥芽糖(分析純) 上海埃彼化學(xué)試劑有限公司;馬鈴薯 市售。

UV.2802H型紫外可見分光光度計(jì) 上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司(進(jìn)口);FA1104N型電子分析天平 上海明橋精密科學(xué)儀器有限公司;ZHWY-211B型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;LHR-250-H型恒溫培養(yǎng)箱 韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司;LDZX-75KB型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申醫(yī)療機(jī)械廠;HS-G-2A型雙人超凈工作臺(tái) 無錫云潔凈化設(shè)備有限公司等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

1.2.1.1 培養(yǎng)基硒溶液的制備 稱取0.10 g硒粉,按照1.2.2.2的方法對(duì)硒粉進(jìn)行消解處理,并用NaOH溶液調(diào)至pH為7,然后定容至1000 mL,此溶液作為硒儲(chǔ)備液(100 μg/mL);取400 mL硒儲(chǔ)備液定容至1000 mL,配成濃度為40 μg/mL的硒溶液,備用。

1.2.1.2 培養(yǎng)基的制備 菌種活化培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g/L、葡萄糖15 g/L、海鹽5 g/L、瓊脂15 g/L,分裝規(guī)格為100 mL/瓶,于121 ℃條件下滅菌30 min,備用;種子培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g/L、葡萄糖15 g/L、海鹽5 g/L,分裝規(guī)格為100 mL/瓶,于12l ℃條件下滅菌30 min,備用。

富硒培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g/L,按照單因素、正交實(shí)驗(yàn)要求加入碳源(葡萄糖、乳糖、麥芽糖及蔗糖);碳源濃度為10～30 g/L,海鹽濃度為0～7 g/L;培養(yǎng)基中不同的硒含量通過添加不同體積的1.2.1.1方法中制得的硒溶液實(shí)現(xiàn),每100 mL培養(yǎng)基添加范圍為10～50 mL,其中,硒溶液濃度為40 μg/mL。其中,以精制海鹽配比培養(yǎng)基的鹽濃度,模擬潮間生長環(huán)境[13]。

1.2.1.3 培養(yǎng)方法 菌種的活化:在無菌條件下,將菌種接種到斜面培養(yǎng)基(菌種活化培養(yǎng)基)后,置于26 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)72 h,菌種長滿平板時(shí)待用;液體種子的制備:在長滿菌種的斜面培養(yǎng)基中加入5～8 mL無菌水,刮取菌絲,采用膠頭滴管吸取適量的混合液體(菌絲+無菌水)于種子培養(yǎng)基中,30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)48 h,菌絲體長滿搖瓶后待用[14];富硒培養(yǎng):往長滿菌體的搖瓶中分別加入不同體積(10、20、30、40、50 mL)的1.2.1.1中硒溶液,以達(dá)到控制硒濃度的目的,培養(yǎng)條件為26 ℃,150 r/min搖床中培養(yǎng)12、24、36、48、60 h。

1.2.2 硒含量測定方法

1.2.2.1 菌絲體生物量的測定 菌絲體收集:硒元素富集時(shí)間結(jié)束后,用濾紙過濾菌絲,并用蒸餾水洗滌3～5次,刮取菌絲體于烘干至恒重的培養(yǎng)皿中,60 ℃下烘干至恒重,稱量其質(zhì)量即可得生物量,以g/L表示。

1.2.2.2 樣品消解 樣品消解方法參照GB5009.93-2010,具體方法為:稱取0.1 g經(jīng)干燥粉碎的均勻試樣于25 mL的比色管中,加入消解液5 mL(濃硝酸與高氯酸混合比例為4∶1)后蓋上玻璃塞并進(jìn)行24 h冷消化處理。水浴加熱消化處理,加熱期間可定時(shí)振蕩比色管以促進(jìn)樣品粉末的完全溶解[15-16]。待樣品溶液呈現(xiàn)透亮、清澈狀態(tài)時(shí),則表明樣品消化完畢,樣品消解過程耗時(shí)大致為3～5 h。于澄清溶液中加入5 mL 6 mol/L鹽酸,沸水浴環(huán)境中進(jìn)行30 min驅(qū)趕硝酸操作,消解液冷卻,備用。

1.2.2.3 硒含量的計(jì)算方法 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定:硒標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稱取0.10 g硒粉,按照1.2.2.2的方法對(duì)硒粉進(jìn)行消解處理后,定容至1000 mL,取400 mL硒儲(chǔ)備液定容至1000 mL,配成濃度為40 μg/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液,備用。于25 mL比色管中,分別吸取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入1.0 mL 1 mol/L HCl溶液、1.0 mL 2 g/L KI溶液、1.5 mL 2 mol/L NaF溶液、1.5 mL 10.0 g/L阿拉伯樹膠溶液,用二次蒸餾水定容混勻,以試劑空白為參比,于352 nm波長下測定溶液的吸光值,并繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線[17-18]。

樣品的測定:將1.2.2.2樣品消解液,于25 mL比色管中加入1.0 mL 1 mol/L HCl溶液、1.0 mL 2 g/L KI溶液、1.5 mL 2 mol/L NaF溶液、1.5 mL 10.0 g/L阿拉伯樹膠溶液,定容混勻,以試劑空白為參比,于352 nm波長下測定溶液的吸光值。

式中,Cx-于校準(zhǔn)曲線查得的硒含量,單位為μg/mL;V-樣品消解液的定容體積,單位為mL;m-測量的樣品質(zhì)量,單位為g;X-單位硒含量,單位為μg/g干菌體。

富硒總量計(jì)算方法:富硒總量(μg/L)=生物量(g/L)×單位硒含量(μg/g干菌體)。

有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率計(jì)算方法:轉(zhuǎn)化率(%)=(富硒總量/硒元素添加總量)×100。其中,硒元素添加總量(μg)=硒溶液添加量(mL)×40 μg/mL(1.2.1.1中硒溶液濃度)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 硒標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量的確定 固定碳源為葡萄糖、碳源濃度20 g/L、鹽濃度5 g/L、培養(yǎng)時(shí)間36 h,考察不同的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量(10、20、30、40、50 mL)對(duì)菌體硒富集能力的影響。

1.2.3.2 鹽濃度的確定 固定碳源為葡萄糖、碳源濃度20 g/L、培養(yǎng)時(shí)間36 h、硒標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量30 mL,考察不同的鹽濃度(0、1.5、3、5、7 g/L)對(duì)菌體硒富集能力的影響。

1.2.3.3 碳源濃度的確定 固定碳源為葡萄糖、鹽濃度5 g/L、培養(yǎng)時(shí)間36 h、硒標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量30 mL,考察不同的碳源濃度(10、15、20、25、30 g/L)對(duì)菌體硒富集能力的影響。

1.2.3.4 培養(yǎng)時(shí)間的確定 固定碳源為葡萄糖、碳源濃度20 g/L、鹽濃度5 g/L、硒標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量30 mL,考察不同的培養(yǎng)時(shí)間(12、24、36、48、60 h)對(duì)菌體硒富集能力的影響。

1.2.3.5 碳源種類的確定 固定碳源濃度20 g/L、鹽濃度5 g/L、培養(yǎng)時(shí)間36 h、硒標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量30 mL,考察不同的碳源(葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖)對(duì)菌體硒富集能力的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇對(duì)菌種富硒能力影響較大的硒標(biāo)準(zhǔn)液添加量、培養(yǎng)時(shí)間、碳源濃度和鹽濃度四個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),因素水平表如表1所示。以每組菌絲體的富硒總量(μg/L)為指標(biāo),確定最佳培養(yǎng)條件。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以試劑空白為參比,于352 nm波長下測定各梯度標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液的吸光值,并繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。測得其溶液吸光度A與溶液硒濃度間線性關(guān)系良好,標(biāo)準(zhǔn)曲線為:A=0.6939 Cx+0.0094,R2=0.9967。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard Curve

圖2 吸收曲線Fig.2 Absorption Curve

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 硒溶液添加量對(duì)菌株富集硒的影響 由圖3可知,硒溶液添加量對(duì)富集硒元素的能力存在較大影響。隨著培養(yǎng)基內(nèi)硒濃度的增大,菌絲體的單位硒含量由43.9 μg/g增加至179.8 μg/g、富硒總量最大值為1923.8 μg/L;當(dāng)硒液添加量為30 mL時(shí),有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率為16.18%。然而,隨著硒溶液添加量的依次增加,菌絲體的生物量由7.7 g/L增至10.7 g/L,然后降至8.9 g/L,總體變化趨勢為先升高后降低。因?yàn)榫z體對(duì)硒有一定的耐受限度濃度,低濃度的硒濃度能促進(jìn)菌絲體生長,進(jìn)而提高菌株富集硒元素的能力;由于硒元素的毒性,高濃度的硒濃度抑制菌絲體的生長,使富集硒元素的能力下降。

圖3 不同硒溶液添加量對(duì)菌株富集硒的影響Fig.3 Effect of different selenium concentration on the enrichment of selenium

2.2.2 鹽濃度對(duì)菌株富集硒的影響 由圖4可知,以添加NaCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的鹽濃度,模擬潮間帶生長的環(huán)境對(duì)菌體的富集硒的能力有促進(jìn)效果。在培養(yǎng)基鹽濃度0～5 g/L時(shí),菌株的生物量由8.7增至10.7 g/L、單位硒含量由16.9 μg/g增加至180. 6 μg/g,增大10倍;而富硒總量最大值為1932.4 μg/L,比不增加NaCl時(shí)增大了13倍。在鹽濃度為5 g/L條件下,有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率為16.21%。培養(yǎng)基中的鹽濃度在0～5 g/L范圍內(nèi)能促進(jìn)菌絲體生長,一般認(rèn)為Cl-的濃度直接影響菌體的酶活力[19],從而提升菌株富集硒元素的能力。

圖4 不同鹽濃度對(duì)菌株富集硒的影響Fig.4 Effect of different concentrations of salt on selenium enrichment

2.2.3 碳源濃度對(duì)菌株富集硒的影響 以葡萄糖作為碳源,探討了不同的碳源濃度對(duì)菌株富硒總量的影響,結(jié)果如圖5所示。在10～30 g/L的碳源濃度范圍內(nèi)增加碳源濃度,菌絲體的生物量曲線趨于平穩(wěn),生物量平均值約為10.6 g/L;然而碳源濃度的增大,對(duì)菌株的富硒能力有明顯的抑制,富硒總量由最高值1792.1 μg/L降至446.5 μg/L,即15 g/L的碳源濃度最適于菌體產(chǎn)生有機(jī)硒代謝產(chǎn)物,有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率僅為14.93%,低于或高于此濃度轉(zhuǎn)化率逐漸降低,其代謝機(jī)制尚未明確。這在真菌發(fā)酵代謝其他活性物質(zhì),如黃酮等有類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[20]。

圖5 不同碳源濃度對(duì)菌株富集硒的影響Fig.5 Effect of different carbon source concentrations on the enrichment of selenium

2.2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株富集硒的影響 培養(yǎng)時(shí)間為24 h時(shí),最適于菌絲體內(nèi)有機(jī)硒產(chǎn)物的積累,富硒總量達(dá)到最高值1940.9 μg/L,單位硒含量增加了1.9倍;超過24 h后,菌絲體的生物量緩慢降低,即菌株的生長受到抑制,甚至出現(xiàn)了菌絲自溶現(xiàn)象。推斷可能的原因是培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)被消耗殆盡,無法為菌株的生長、富集硒提供必需的條件。因此,選擇12、24、36 h的3個(gè)因素水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖6 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株富集硒的影響Fig.6 Effect of different incubation time on the enrichment of selenium

2.2.5 碳源種類對(duì)菌株富集硒的影響 葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖四種碳源條件下,所得的菌絲體生物量分別為10.3、10.8、10.8、9.8 g/L,生長曲線趨于平穩(wěn),以葡萄糖、乳糖作為培養(yǎng)碳源時(shí),有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率約為14.0%,富硒總量分別為1634.4 μg/L和1740.1 μg/L,明顯優(yōu)于麥芽糖、蔗糖,當(dāng)使用蔗糖作為碳源時(shí),富硒總量僅為609.9 μg/L。由此可見,不同的碳源直接影響菌株的硒富集能力。蔗糖屬于大分子物質(zhì)非還原性糖類,不具有游離的醛基與酮基,不利于菌體直接吸收利用,因而引起硒富集低[21-22]。

圖7 不同碳源種類對(duì)菌株富集硒的影響Fig.7 Effect of different carbon sources on the enrichment of selenium in strains

2.3正交實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2,4種因素主次順序?yàn)镈>A>B>C,表明培養(yǎng)基的鹽濃度、硒含量是菌株的富集硒主要影響因素,富硒培養(yǎng)基最佳的組合水平為A2B2C2D2,即鹽濃度5 g/L,硒溶液添加量30 mL,培養(yǎng)時(shí)間24 h,碳源(葡萄糖)濃度15 g/L。在最優(yōu)化水平驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果,富硒總量為1941.7 μg/L,菌絲體生物量為10.7 g/L,有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率為16.2%。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

3 結(jié)論

在自然條件下,特別是在缺硒地區(qū),適量的補(bǔ)硒可以防治動(dòng)物因體內(nèi)硒含量過低而引發(fā)疾病[2-3]。因此,獲得安全有效的硒源是關(guān)鍵。本文采用單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)紅樹林植物闊苞菊內(nèi)生真菌的硒富集能力及培養(yǎng)條件進(jìn)行研究,確定了最適于的發(fā)酵條件為:硒溶液添加量為30 mL,鹽濃度5 g/L,碳源(葡萄糖)濃度15 g/L,培養(yǎng)時(shí)間24 h。發(fā)酵得到菌絲體富硒總量為1941.7 μg/L,有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率僅為16.2%,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)菌絲體在加入硒溶液后培養(yǎng)初期出現(xiàn)了自溶現(xiàn)象,以致結(jié)果與文獻(xiàn)值[22]相比偏低。海洋是地球上最大的微生物生存的寶庫,因此進(jìn)一步篩選有機(jī)硒轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)的海洋紅樹林植物內(nèi)生菌種,對(duì)開發(fā)利用海洋真菌,同時(shí)豐富有機(jī)硒來源途徑,具有較大的科研意義。

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