黑曲霉所產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)及其在異槲皮素制備上應(yīng)用

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(1.南昌大學(xué)資源環(huán)境與化工學(xué)院,江西南昌 330031;2.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院,江西南昌 330031;3.中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047)

黃酮類化合物廣泛存在于自然界,是大多藥用植物的有效成分,普遍具有抗炎抑菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射和免疫調(diào)節(jié)等多種活性,是國內(nèi)外天然藥物開發(fā)利用的研究熱點[1-2],但是多數(shù)黃酮苷元或黃酮苷類在水相中溶解度低,大大限制了其藥物制劑的開發(fā),目前國內(nèi)外主要通過去糖基化,對黃酮類化合物進行分子修飾以提高其在水相中的溶解性。對于復(fù)雜結(jié)構(gòu)的天然活性成分,利用化學(xué)合成來進行結(jié)構(gòu)修飾存在著得率低、反應(yīng)專一性差、副產(chǎn)物多等缺點,特別是有些反應(yīng)目前利用化學(xué)手段較難實現(xiàn)。而生物轉(zhuǎn)化技術(shù)卻可彌補化學(xué)合成的不足,已經(jīng)報道許多研究人員篩選出來產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的菌株[3-5],這種酶可以將一些黃酮類化合物的末端糖基去掉以增加黃酮類化合物的水溶性和穩(wěn)定性,降低其細胞毒性[6]。

α-L-鼠李糖苷酶是一種水解末端鼠李糖糖苷的水解酶類,能高效、專一水解α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6位連接的糖苷鍵,可應(yīng)用于水解部分黃酮類化合物。α-L-鼠李糖苷酶來源廣泛,分布于動物組織[7]、植物[8]、微生物[9-10]中。目前國內(nèi)對微生物產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的研究,主要集中在黑曲霉[11-13]上;國外研究主要涉及的菌種有黑曲霉、棘孢曲霉、白曲霉、青霉菌、土曲霉、構(gòu)巢曲霉、熱微菌門和擬桿菌屬等[14-16]。

作者采用實驗室前期篩選的1株黑曲霉[17]進行液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶,通過簡單的硫酸銨鹽析,膜透析即可獲得α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液,同時對該粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)進行深入探討。后期該粗酶液對蘆丁進行去糖基化得到異槲皮素(Isoquercitrin),同時對產(chǎn)物進行了結(jié)構(gòu)分析。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

黑曲霉 實驗室篩選菌株;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、異槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品 HPLC≥98%,上海源葉生物有限公司;酵母提取物、蛋白胨 美國OXOID公司;瓊脂粉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS) solarbio公司;甘氨酸、透析袋 Acros公司;考馬斯亮藍R-250、SDS上樣緩沖液、蛋白質(zhì)marker(200 kDa) Takara公司,其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

SPD-15C型高效液相色譜儀 日本島津有限公司;TGL-16C型離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;M3型電熱循環(huán)水浴鍋 德國LAUDA公司;mLS-3750型滅菌鍋 日本SANYO公司;HWY-200型全溫搖床 常州諾基儀器有限公司;SW-CT-1D型超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;2720型PCR儀 美國ABI有限公司;DYY-10C型垂直電泳儀 北京六一儀器廠;Gel Doe XR型膠掃描系統(tǒng) 美國BIO-RAD公司。

1.2實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 斜面培養(yǎng)基(g/L):KNO31.5,MgSO4·7H2O 1.0,KH2PO41.0,(NH4)2SO41.5,KCl 0.5,無水CaCl20.1,酵母膏2.0,蘆丁2.5,瓊脂15。初始pH6.0,121 ℃滅菌20 min,倒平板。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):KNO31.5,MgSO4·7H2O 1.0,KH2PO41.0,(NH4)2SO41.5,KCl 0.5,無水CaCl20.1,酵母膏2.0,蘆丁2.5。初始pH6.0,121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 菌株的培養(yǎng) 將黑曲霉接種斜面培養(yǎng)基上,于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)5 d,待斜面上長滿黑褐色孢子,用接種針挑取孢子,用0.9%的生理鹽水洗滌數(shù)次,然后30 ℃振蕩培養(yǎng)2 h,配成懸濁液,按體積分數(shù)10%的接種量接種于液體培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。

1.2.3 粗酶液的制備 取發(fā)酵液于4 ℃、3000×g離心10 min后,取上清液。緩慢取50 mL的上清液加入(NH4)2SO4粉末至其飽和度70%,邊添加邊攪拌,4 ℃靜置過夜,然后4 ℃、8000×g冷凍離心20 min,得到的沉淀用一定體積HAc-NaAc緩沖液(10 mmol/L,pH5.5)溶解。置于透析袋中,4 ℃透析2 d,每隔4 h換一次透析液。透析完畢,取出透析液,所得到的袋內(nèi)的透析液即為粗酶液。

1.2.4 酶蛋白分子量測定 采用SDS-PAGE法測定酶蛋白分子量。分離膠和濃縮膠濃度分別為10%和5%,上樣量為20 μL。先用80 V電泳30 min,再用120 V電泳90 min。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍染色45 min,過夜脫色。

1.2.5 酶活的測定 分別配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的異槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液,用HPLC檢測,記錄峰面積,做異槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。HPLC條件:分離柱為4.6 mm×250 mm Hypersil ODS 5 μm,流動相為 甲醇:0.1%三氟乙酸水溶液=40∶60,流速為0.5 mL/min,進樣量10 μL,檢測波長360 nm,柱溫30 ℃。取pH5.5的HAC-NaAC緩沖液溶液2.0 mL于試管中,加入1 mL粗酶液,在40 ℃下水浴保溫5 min,再加入2.0 mL 300 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,在55 ℃下水浴反應(yīng)45 min后于沸水中滅活20 min,取出后迅速冷卻至室溫,用HPLC測定異槲皮素的峰面積,計算生成物含量。酶活定義,在上述條件,每分鐘生成1 μg異槲皮素所需要的酶量定義為一個酶活(U/mL)。

1.3α-L-鼠李糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.1 粗酶液的最適溫度 取2 mL 10 mg/mL蘆丁懸濁液,加入2 mL HAc-NaAc緩沖液(10 mmol/L,pH5.5)分別與1 mL粗酶液在30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃的溫度條件下進行反應(yīng),反應(yīng)45 min后,測定異槲皮素的含量,計算相對酶活,相對酶活=實際測得酶活/實驗中最大酶活。根據(jù)相對酶活的大小,確定酶的最適反應(yīng)溫度。

1.3.2 粗酶液的熱穩(wěn)定性研究 分別取1 mL的α-L-鼠李糖苷酶分別置于20、30、40、50、60、70、80 ℃的條件下保溫2 h后,取出與2 mL 10 mg/mL蘆丁懸濁液和2 mL HAc-Nac緩沖液(10 mmol/L,pH5.5)進行反應(yīng),反應(yīng)45 min后,測定異槲皮素的含量,比較酶經(jīng)過不同溫度處理后的相對酶活,確定其熱穩(wěn)定性。

1.3.3 粗酶液的最適pH 取2 mL 10 mg/mL蘆丁懸濁液,加入2 mL HAc-NaAc緩沖液(10 mmol/L,pH5.5)分別與1 mL酶液在pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0的條件下進行反應(yīng),反應(yīng)45 min后,測定異槲皮素的含量,計算相對酶活,確定酶的最適pH。

1.3.4 粗酶液的pH穩(wěn)定性研究 分別取1 mL的α-L-鼠李糖苷酶分別置于pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的條件下,靜置2 h后,取出與2 mL 10 mg/mL蘆丁懸濁液和2 mL HAc-NaAc緩沖液(10 mmol/L,pH5.5)進行反應(yīng),反應(yīng)45 min后,測定異槲皮素的含量,計算相對酶活,比較酶經(jīng)過不同pH緩沖液處理后的相對酶活,確定其pH穩(wěn)定性。

1.4蘆丁的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)及反應(yīng)產(chǎn)物的分離純化

1.4.1 蘆丁的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng) 稱取0.50 g 蘆丁制成40 mL的懸濁液,加入40 mL HAc-NaAc緩沖液(10 mmol/L,pH5.5)分別與10 mL的酶液混合,于55 ℃反應(yīng)45 min后,用沸水終止反應(yīng)。取反應(yīng)液進行薄層色譜分析,并與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品進行對照,展開劑比例為乙酸乙酯∶丙酮∶乙酸∶甲醇=5∶3∶1∶1。并用HPLC分別測定反應(yīng)液中蘆丁和異槲皮素的峰面積,計算蘆丁的轉(zhuǎn)化率。

1.4.2 產(chǎn)物的分離純化 將反應(yīng)液蒸干,于真空干燥箱過夜。硅膠經(jīng)烘干預(yù)處理后干法裝入層析柱(2.0 cm×50 cm)中,壓緊。準(zhǔn)確稱取一定量的反應(yīng)物粗提物溶解于少量的洗脫劑(洗脫劑比例為乙酸乙酯∶甲醇=8∶1)中,加到柱上方,再泵入洗脫劑進行柱層析。并開始計時、取樣。TLC跟蹤檢測,進行分段收集。含有異槲皮素的洗脫液合并蒸干,測定含量,計算蘆丁的轉(zhuǎn)化率,轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化的蘆丁/總蘆丁。

1.5產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析

取大約10 μg樣品溶于1 mL色譜級甲醇中,振蕩搖勻,交給南昌大學(xué)分析測試中心進行質(zhì)譜分析(LC-MS,一級質(zhì)譜);同時取10 mg樣品(粉末狀態(tài))放在核磁管中,交給南昌大學(xué)分析測試中心進行1HNMR分析。2 d后返回質(zhì)譜和氫譜結(jié)果,并結(jié)合譜圖進行分析確認。

1.6統(tǒng)計分析

所有實驗至少設(shè)3次重復(fù),采用SPSS V21.0軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1酶蛋白分子量與酶活測定

2.1.1 酶蛋白分子量測定 根據(jù)文獻報道α-L-鼠李糖苷酶的分子量在40～170 kDa之間[18-21],本實驗采用SDS-PAGE方法測定粗酶液的分子量,如圖1所示,泳道1為蛋白marker,泳道2為粗酶液,通過SDS-PAGE蛋白質(zhì)遷移率實驗計算得蛋白質(zhì)分子量為58.1 kDa。

圖1 粗酶的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis of crude enzyme.注:泳道1.蛋白marker；2.粗酶液。

2.1.2 酶活的測定 分別配制不同濃度的異槲皮素,利用HPLC測定各濃度異槲皮素的峰面積,根據(jù)峰面積與異槲皮素的濃度關(guān)系,做異槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖2所示。反應(yīng)結(jié)束后,用HPLC測定異槲皮素的峰面積,其峰面積為9.85×106,所以反應(yīng)液中異槲皮素的濃度為0.798 mg/mL。通過計算得到粗酶液酶活為798 U/mL。

圖2 異槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Curve of isoquercetin

2.2α-L-鼠李糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 溫度對酶活的影響 酶催化的反應(yīng)速率與溫度密切相關(guān),因此溫度是α-L-鼠李糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究的重要因素。文獻報道,不同來源的α-L-鼠李糖苷酶,其最適反應(yīng)溫度也各不相同,但多在30～60 ℃[19-23]。將純化后得到的α-L-鼠李糖苷酶在不同溫度(30～80 ℃)下進行酶活性測定,結(jié)果如圖3所示:當(dāng)溫度由30～55 ℃逐步上升時,酶的活力隨著溫度的升高逐漸增強,到55 ℃時,酶活力最高,而55 ℃之后,隨著溫度的升高,酶的活力逐漸降低,當(dāng)溫度增加到80 ℃以上時,酶全部失活。因此,根據(jù)以上數(shù)據(jù),可以確定酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃。

圖3 α-L-鼠李糖苷酶的最適反應(yīng)溫度Fig.3 The optimal reaction temperature of alpha-L-rhamnosidase

2.2.2 酶的熱穩(wěn)定性研究 為了進一步研究溫度對α-L-鼠李糖苷酶穩(wěn)定性的影響,將酶液于20～80 ℃條件下保溫2 h后,進行酶活力的測定,結(jié)果如圖4所示:α-L-鼠李糖苷酶在20～40 ℃條件下保溫,酶活力下降不明顯,能保持在原酶活的85%以上;而當(dāng)溫度超過50 ℃時,酶活力迅速下降迅速下降;在80 ℃時,粗酶液幾乎全部失活。

圖4 α-L-鼠李糖苷酶的熱穩(wěn)定性Fig.4 The temperature stability of alpha-L-rhamnosidase

圖5 α-L-鼠李糖苷酶的最適反應(yīng)pHFig.5 The optimal reaction pH of alpha-L-rhamnosidase

2.2.3 pH對酶活的影響 據(jù)文獻報道,α-L-鼠李糖苷酶的最適pH大部分在4.5～6.0之間[19-23],用pH4.0～8.0的緩沖溶液(10 mmol/L)配制底物和稀釋酶液,檢測pH對α-L-鼠李糖苷酶活性的影響,得到如圖5所示:α-L-鼠李糖苷酶屬于酸性酶,其中pH在4.0～5.5時,酶活快速增大,pH為5.5時,酶活達到最大,pH大于5.5時,酶活迅速降低。因此,可以確定,酶反應(yīng)的最適pH為5.5。

2.2.4 酶的酸堿穩(wěn)定性研究 酶液置于pH2.0～9.0 的緩沖液(10 mmol/L)中24 h后,測定pH對α-L-鼠李糖苷酶穩(wěn)定性的影響。如圖6所示,在pH小于5.0 和pH大于6.5時,可能由于α-L-鼠李糖苷酶發(fā)生了失活現(xiàn)象,因此酶活性急劇降低。

圖6 α-L-鼠李糖苷酶的酸堿穩(wěn)定性Fig.6 The pH stability of alpha-L-rhamnosidase

2.3蘆丁的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)及產(chǎn)物分離純化

2.3.1 蘆丁的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng) 通過酶解產(chǎn)物與異槲皮素、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的薄層層析圖譜,如圖7所示,蘆丁在實驗所得高純度α-L-鼠李糖苷酶的作用下,幾乎全部轉(zhuǎn)化生成了唯一產(chǎn)物[24-26],其中蘆丁的遷移率Rf為0.29,異槲皮素的遷移率Rf為0.72,產(chǎn)物的遷移率Rf為0.72,Rf=點樣基線至展開斑點中心的距離/從基線到展開前沿的距離。因此可初步確定其反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)為異槲皮素。

圖7 反應(yīng)產(chǎn)物TLC分析Fig.7 The reaction products of TLC注:1.蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品；2.異槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品；3.產(chǎn)物。

為了進一步檢測異槲皮素的產(chǎn)率,進行HPLC檢測,檢測反應(yīng)產(chǎn)物中的蘆丁與異槲皮素的情況。圖譜如圖8所示,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間是7.824 min,異槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間是8.633 min,如圖9所示,反應(yīng)產(chǎn)物出峰時間是8.537 min。根據(jù)HPLC圖譜的峰面積,異槲皮素的含量高達95%。因此,可以判斷酶解生成的產(chǎn)物應(yīng)為異槲皮素,也進一步證明本實驗純化獲得的α-L-鼠李糖苷酶具有良好的酶解效果,專一性好且轉(zhuǎn)化率高。

圖8 標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜Fig.8 HPLC of standard map

圖9 反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖譜Fig.9 HPLC of reaction products

2.3.2 產(chǎn)物的分離純化 將柱層析得到的產(chǎn)物進行質(zhì)譜分析,如圖10所示:一共出現(xiàn)3個峰型,ESI-MS m/z(%):464.09[M]+,927.19、435.13。其中464.09可以確定是異槲皮素的相對分子質(zhì)量,其核磁氫譜如圖11所示。

圖10 產(chǎn)物的質(zhì)譜分析Fig.10 MS of the products

圖11 產(chǎn)物的核磁氫譜分析Fig.11 NMR of the products

1H-NMR(CH3DO,600 MHz)δ:7.709(d,1H),7.589(1H,dd),6.873(1H,d),6.873(1H,d),6.392(1H,d),6.200(1H,d),5.257(1H,d),4.848(1H,s),3.723(1H,dd),3.587(1H,m),3.494(1H,t),3.331(1H,t),3.209(1H,m)。

3 結(jié)論

由實驗結(jié)果可以得出,利用黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶,該粗酶液的酶活達到了798 U/mL;利用α-L-鼠李糖苷酶將蘆丁轉(zhuǎn)化為異槲皮素,傳統(tǒng)方法制備異槲皮素需要高溫高壓,對設(shè)備要求高,該方法比傳統(tǒng)的化學(xué)法有更多優(yōu)勢,反應(yīng)條件溫和,反應(yīng)時間短,對底物的選擇性強,并且反應(yīng)過程容易控制,轉(zhuǎn)化率高達95%。同時對酶學(xué)性質(zhì)進行探究,酶蛋白的分子量為55 kDa,酶反應(yīng)的最適溫度是55 ℃,最適pH是5.5。通過酶法水解蘆丁,為實現(xiàn)異槲皮素的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

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