酶法制備大豆肽的相對分子量分布及降壓作用研究

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(1.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東濟(jì)南 250355;2.安徽生物肽產(chǎn)業(yè)研究院有限公司,安徽蕪湖 241000;3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東青島 266000)

我國是世界大豆的主產(chǎn)國之一,大豆資源豐富,大豆分離蛋白是大豆榨油的副產(chǎn)品,目前主要用于飼料,開發(fā)利用率不高,浪費(fèi)嚴(yán)重,這不僅是對可利用糧食資源的極大浪費(fèi),而且對環(huán)境造成一定程度的污染[1]。大豆分離蛋白中氨基酸種類有近20種,并含有人體必需氨基酸,其營養(yǎng)豐富,不含膽固醇,是植物蛋白中為數(shù)不多的可替代動物蛋白的品種之一。但大豆分離蛋白分子量大,生物利用度低等缺點(diǎn),然而大豆肽的相對分子量更小,較容易被吸收利用,活性強(qiáng),尤其是具有降血壓、降低膽固醇、抗氧化、抗疲勞等獨(dú)特的生理活性[2-5]。因此,大豆肽作為一種比大豆分離蛋白更佳的新型大豆深加工產(chǎn)品,已經(jīng)在食品飲料行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)等領(lǐng)域顯示出獨(dú)特的開發(fā)前景。但目前研究主要在大豆分離蛋白酶解工藝的考察,但對大豆肽酶解液的相對分子量組分分布及降壓活性片段的報(bào)道較少。本研究通過采取雙酶復(fù)合酶解大豆分離蛋白,酶解液通過納濾、超濾以獲得具有較高生理活性的活性肽;采用高效液相色譜法,對大豆酶解液的相對分子量分布進(jìn)行測定,將處理后活性分子量組分進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn),研究其對大鼠高血壓模型的影響,為大豆蛋白科學(xué)合理的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

大豆分離蛋白 山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司,蛋白質(zhì)含量≥90%;胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶 批號20151015、20150207,酶活力均≥2500 U/mg,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;左旋硝基精氨酸(L-NNA)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)標(biāo)準(zhǔn)樣品 Sigma公司;托普利片 山西津華暉星制藥有限公司,25 mg/片,批號:160803;相對分子質(zhì)量標(biāo)定物牛血清白蛋白(分子質(zhì)量:66430 Da,批號:081608)、低分子肝素鈉(分子質(zhì)量:3700 Da,批號:160406)、人血管緊張素Ⅱ(分子質(zhì)量:1045.5 Da,批號:20150420)、乙氨酰乙氨酰乙氨酸(分子質(zhì)量:189.1 Da,批號:20150626) 由中國計(jì)量科學(xué)研究院提供;氯化鈣、氫氧化鈉、鹽酸 濟(jì)寧宏明化學(xué)試劑有限公司;茚三酮 濟(jì)南躍陽化工有限公司;以上試劑為分析純;水 純水。SD大鼠 50只,體重180～200 g,雌雄各半,由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司提供,批號20170220,動物合格證號:SCXK(魯)2017-0003。

LC-2010A型高效液相色譜儀 日本島津公司;包括紫外檢測器、DAD檢測器、CLASS-VP工作站;UV1100型紫外可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菠蘿蛋白酶與胰蛋白酶水解大豆分離蛋白的單因素實(shí)驗(yàn) 大豆分離蛋白中含有一定量的膳食纖維和淀粉[6],具有較強(qiáng)的吸水膨脹能力,料液比過低時(1∶10 g/mL)物料變得粘稠,流動性差,難以攪拌;當(dāng)料液比為1∶20 g/mL時流動性較好時,分別考察菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶的酶解時間、酶底比、酶解pH、酶解溫度等因素對大豆分離蛋白水解度的影響。

1.2.1.1 酶解時間的確定 在料液比為1∶20 g/mL時,調(diào)節(jié)pH為7.0、溫度為50 ℃、加入底物量3.0%蛋白酶,分別在酶解時間為1、2、3、4、5 h時進(jìn)行酶解反應(yīng),初步確定菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶酶解時間。

1.2.1.2 酶與底物的比的確定 在料液比為1∶20 g/mL時,調(diào)節(jié)pH為7.0、溫度為50 ℃、酶解時間為3 h,分別在酶底比為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%時測其水解度,初步確定菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶酶解酶底比。

1.2.1.3 酶解pH的確定 在料液比為1∶20 g/mL時,調(diào)節(jié)溫度為50 ℃、加入底物量3.0%蛋白酶、酶解時間為3 h,分別測定在酶解pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0時的水解度,初步確定菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶酶解玉米蛋白的最佳酶解pH。

1.2.1.4 酶解溫度的確定 在料液比為1∶20 g/mL時,調(diào)節(jié)pH為7.0、加入底物量3.0%蛋白酶、酶解時間為3 h,分別在溫度為35、40、45、50、55 ℃時進(jìn)行酶解反應(yīng),初步確定菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶酶解溫度。

1.2.2 雙酶復(fù)合酶解正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 前期實(shí)驗(yàn)通過單因素考察及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出菠蘿蛋白酶對大豆分離蛋白的最佳酶解工藝:在料液比為1∶20 g/mL的情況下,酶解溫度50 ℃,菠蘿蛋白酶酶底比3.0%,酶解pH7.0條件下酶解2 h;本實(shí)驗(yàn)通過胰蛋白酶單因素實(shí)驗(yàn)確定以胰蛋白酶酶解時間、酶解溫度、酶底比、酶解pH為胰蛋白酶雙酶復(fù)合酶解的考察因素,采用4因素3水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),即L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn),見表1。

表1 雙酶復(fù)合酶解正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment of double enzyme complex enzyme hydrolysis

1.2.3 菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶單酶及雙酶(不同順序)復(fù)合酶解對比研究 單酶酶解(菠蘿蛋白酶):在料液比為1∶20 g/mL的情況下,酶解溫度50 ℃,酶底比3.0%,酶解pH7.0條件酶解2 h。

單酶酶解(胰蛋白酶):在料液比為1∶20 g/mL的情況下,酶底比4.0%加入胰蛋白酶,控制溫度為40 ℃、酶解pH為8.0條件下酶解4 h。

雙酶酶解(先菠蘿蛋白酶后胰蛋白酶):在料液比為1∶20 g/mL的情況下,酶解溫度50 ℃,酶底比3.0%,酶解pH7.0條件下先用菠蘿蛋白酶酶解2 h后,再以酶底比4.0%加入胰蛋白酶,溫度為40 ℃、酶解pH8.0條件下酶解4 h。

雙酶酶解(先胰蛋白酶后菠蘿蛋白酶):在料液比為1∶20 g/mL的情況下,在酶解溫度40 ℃,酶底比4.0%,酶解pH8.0時先用胰蛋白酶酶解4 h后,再以酶底比3.0%加入菠蘿蛋白酶,控制溫度為50 ℃、酶解pH為7.0條件下酶解2 h。

1.2.4 大豆分離蛋白水解度(DH)的測定 茚三酮法[7]蛋白質(zhì)水解過程中被裂解的肽鍵數(shù)h(mmol/g)與蛋白質(zhì)的總肽鍵數(shù)htot(mmol/g)之比稱為水解度(the degree of hydrolysis);

DH(%)=h/htot×100

式中,h-水解后每克蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)(mmoL/g);htot-每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)(mmoL/g)。

1.2.5 體外降壓肽對ACE抑制率的測定 前期的活性分析以其天然底物血管緊張素,采用放射色譜法、比色法或放射免疫法等方法分析,但由于該過程操作較復(fù)雜、干擾多、底物昂貴等缺點(diǎn)而不適合廣泛應(yīng)用,故采用HPLC體外檢測分析不同酶解條件下制備的酶解降壓肽對應(yīng)的ACE抑制活性。有關(guān)步驟參照 Cushman(1971)和Toshiro(1993)改進(jìn)的方法進(jìn)行[8-9]。將各酶解液反應(yīng)值 A與空白樣品值 A(control)對照,分析所得酶解降壓肽的 ACE抑制率。其計(jì)算公式為:

ACE抑制率(%)=(A-Acontrol)/A×100

1.2.6 大豆肽超濾分段實(shí)驗(yàn) 將預(yù)先處理后的酶解液樣品進(jìn)行離心操作,4500 r/min離心5 min后合并上清液,去離子水定容至3000 mL。將已處理的3000 Da超濾膜裝入膜處理設(shè)備,去離子水清洗5 min后,將離心后的酶解液樣品倒入樣品池內(nèi),進(jìn)行超濾操作[10]。參數(shù)為壓力0.20 MPa,超濾時間120 min,溫度35 ℃,分別收集>3000 Da樣品和<3000 Da樣品。將超濾處理完的<3000 Da樣品進(jìn)行1000 Da超濾膜實(shí)驗(yàn),分別制得<1000 Da樣品和1000～3000 Da樣品。

1.2.7 標(biāo)記物標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

1.2.7.1 色譜條件 色譜柱為TSKgeLG2000SWXL(7.8 mm×300 mm,平均孔徑512A),流動相為0.1 mol/L NaCl+0.05% NaN3+0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH6.7),柱溫為室溫(25 ℃),流速0.5 mol/min,檢測波長280 nm[11]。

1.2.7.2 標(biāo)準(zhǔn)分子量對照品溶液制備 分別取牛血清白蛋白(分子量66430 Da)5 mg、低分子肝素鈉(分子量3700 Da)3 mg、血管緊張素(分子量1045.5 Da)3 mg、乙氨酰乙氨酰乙氨酸(分子量189.1 Da)2 mg溶解至10 mL去離子水中,作為標(biāo)準(zhǔn)分子對照品溶液。

1.2.8 大豆肽(1000～3000 Da)體內(nèi)活性測定實(shí)驗(yàn)

1.2.8.1 L-NNA致大鼠高血壓動物模型的建立 用L-NNA對大鼠腹腔注射進(jìn)行誘導(dǎo),每日15 mg/kg/d,分2次腹腔注射,連續(xù)應(yīng)用4周[12]。

1.2.8.2 分組及給藥 將50只大鼠,分成5組,分別為模型對照組(純水)、卡托普利組(1.0 mg/mL)、大豆肽低劑量組(0.6 g/mL)、大豆肽中劑量組(0.8 g/mL)和大豆肽高劑量組(1.0 g/mL)。模型對照組:造模后1周給2 mL/d純凈水灌胃,連續(xù)4周;卡托普利組:造模后1周給2 mL/d卡托普利液灌胃,連續(xù)4周;大豆肽三個劑量組:造模后1周按照不同濃度給予超濾后1000～3000 Da大豆肽酶解液2 mL/d,連續(xù)4周。

1.2.8.3 血壓的測量 測壓前將大鼠放入(37±1) ℃電熱恒溫箱內(nèi),加熱使大鼠尾動脈充分?jǐn)U張,用大鼠血壓測定儀間接測大鼠尾動脈的收縮壓,分別測定造模前、造模后及造模后2周、4周的血壓。

1.3數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶酶解大豆分離蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)

醫(yī)護(hù)人員應(yīng)當(dāng)做好患者的飲食護(hù)理工作。對婦產(chǎn)科患者來說,其日常主食應(yīng)當(dāng)以營養(yǎng)為主[4],所以,護(hù)理人員應(yīng)當(dāng)依據(jù)患者自身的情況來確定每天的進(jìn)食量,對妊娠患者在餐前和餐后對患者的血糖進(jìn)行測量。一旦個別患者的血糖發(fā)現(xiàn)較大變化,則應(yīng)當(dāng)及時向主治醫(yī)生匯報(bào),立即調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)。

2.1.1 酶解時間對水解度的影響 由圖1可知,隨著酶解反應(yīng)時間的延長,水解度呈不斷增大的趨勢,胰蛋白酶水解到3 h時,水解度較高,但再繼續(xù)延長酶解時間,水解度變化不大;菠蘿蛋白酶水解到2 h時,水解度較高,再繼續(xù)延長酶解時間,水解度變化不大;菠蘿蛋白酶屬于巰基蛋白酶,作用位點(diǎn)較廣泛無特異性,酶解速度快;胰蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶,能選擇性地水解蛋白質(zhì)中賴氨酸或精氨酸的羧基端肽鍵,專一性較強(qiáng),酶解時間相對較長[2],所以考慮經(jīng)濟(jì)效益,胰蛋白酶酶解時間3 h為宜、菠蘿蛋白酶酶解時間2 h為宜。

圖1 酶解時間對菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶酶解水解度的影響Fig.1 Effect of enzymolysis time on the hydrolysis degree of bromelain and trypsin

2.1.2 酶底比對水解度的影響 由圖2可以看出,菠蘿蛋白酶與胰蛋白酶的水解度隨著酶底比的增加而增加,當(dāng)菠蘿蛋白酶酶底比在1.0%～3.0%范圍內(nèi)時,當(dāng)胰蛋白酶酶底比在1.0%～3.0%范圍內(nèi)時,水解度增加較為明顯,繼續(xù)增大酶底比時,水解度的增加趨勢則較為平緩。這是因?yàn)殡S著酶底比的增加,酶濃度增大,使蛋白質(zhì)充分酶解,當(dāng)酶濃度達(dá)到一定值后逐漸趨于飽和,酶解反應(yīng)也隨之趨于平緩;在酶解過程中酶的價格相對較高,故最佳的加酶量既能完全酶解蛋白又能夠節(jié)約成本,所以菠蘿蛋白酶得酶底比確定為3.0%較為合適,胰蛋白酶的酶底比為3.0%為最優(yōu)。

圖2 酶底比對菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶酶解水解度的影響Fig.2 Effect of Substrate Ratio on the hydrolysis degree of bromelain and trypsin

2.1.3 酶解pH對水解度的影響 由圖3可以看出,胰蛋白酶在酶解pH為5.0～8.0時、菠蘿蛋白酶在酶解pH為5.0～7.0時水解度隨著酶解pH的增大而增大,當(dāng)繼續(xù)增大酶解pH時,水解度均開始減小,這是由于不同的酶酶活力的適宜pH范圍不同。菠蘿蛋白酶屬于植物酶,胰蛋白酶是胰腺的外分泌部分泌的,在小腸里對蛋白質(zhì)消化有無法替代的作用,而小腸中為堿性環(huán)境;胰蛋白酶最適酶解pH為8.0,菠蘿蛋白酶最適酶解pH為7.0。

圖3 酶解pH對菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶酶解水解度的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis of pH on the hydrolysis degree of bromelain and trypsin

2.1.4 酶解溫度對水解度的影響 由圖4可以看出,胰蛋白酶的最適溫度在(35～45) ℃范圍內(nèi),當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時,模擬了人體內(nèi)溫度,故胰蛋白酶酶解效果最佳,當(dāng)達(dá)到40 ℃后繼續(xù)升高溫度,水解度反而減小;菠蘿蛋白酶的最適反應(yīng)溫度介于(45～55) ℃,達(dá)到50 ℃后繼續(xù)升高溫度,水解度減小,這是因?yàn)殡S著溫度的升高,酶促反應(yīng)速度加快,當(dāng)高于最適反應(yīng)溫度后,酶活力減小,水解度也隨之減小,故胰蛋白酶酶解溫度確定為40 ℃,菠蘿蛋白酶酶解溫度確定為50 ℃為宜。

圖4 酶解溫度對菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶酶解水解度的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the hydrolysis degree of bromelain and trypsin

2.2雙酶復(fù)合酶解制備大豆肽工藝優(yōu)化研究

2.2.1 雙酶復(fù)合酶解制備大豆肽的正交實(shí)驗(yàn) 由表2雙酶復(fù)合酶解正交實(shí)驗(yàn)極差分析表明,由極差R得出影響因素大小順序?yàn)?C>B>D>A,即酶底比>酶解溫度>酶解pH>酶解時間;由均值k得出最佳因素組合為 A2B2C3D2,即在在料液比1∶20 g/mL的情況下先用菠蘿蛋白酶在酶解溫度50 ℃,酶底比3.0%,酶解pH7.0條件下酶解2 h后,再以酶底比4.0%加入胰蛋白酶,控制溫度為40 ℃、酶解pH為8.0條件下酶解4 h。

表2 雙酶復(fù)合酶解正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test of double enzyme complex enzyme hydrolysis

2.2.2 雙酶復(fù)合酶解正交實(shí)驗(yàn)方差分析 由方差分析表3的F值可知,4種因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度各不相同,影響程度依次為:酶底比>酶解溫度>酶解pH>酶解時間。由p值可知,因素C即酶底比有顯著性差異(p<0.01),這與直觀考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 3 Variance Analysis of orthogonal experiment

注:*代表p<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 依據(jù)最佳雙酶復(fù)合酶解的條件:料液比為1∶20 g/mL的情況下,在酶解溫度50 ℃,酶底比3.0%,酶解pH7.0條件下先用菠蘿蛋白酶酶解2 h后,再以酶底比4.0%加入胰蛋白酶,控制溫度為40 ℃、酶解pH為8.0條件下酶解4 h,大豆分離蛋白的水解度較好為35.31%。

表6 各組大鼠血壓變化Table 6 The changes of blood pressure of rats(±s,n=10)

注:與模型對照組比較,*p<0.05 為有顯著性差異;**p<0.01 為有極顯著性差異。

2.3菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶單酶及雙酶酶解對比研究

從表4可知,雙酶復(fù)合酶解較單酶酶解水解度和ACE抑制率高,在雙酶復(fù)合酶解中先用菠蘿蛋白酶酶解在胰蛋白酶酶解最優(yōu),故本實(shí)驗(yàn)選擇先菠蘿蛋白酶酶解再胰蛋白酶酶解的雙酶酶解工藝。

表4 單酶及雙酶對比研究Table 4 Comparison of single and double enzyme enzyme

2.4不同分子量大豆肽百分比

在雙酶復(fù)合酶解液后,通過超濾后得到不同分子量的大豆肽,從表5中可知,1000～3000 Da的分子量比重較大為67.99%,對ACE抑制率較高,從而推斷出活性片段為1000～3000 Da。

表5 不同分子量大豆肽百分比結(jié)果Table 5 The percentage of soybean peptides with different molecular weight

2.5樣品分子量分布測定

取標(biāo)記物溶液、大豆蛋白原液、大豆蛋白酶解液按1.2.7.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,標(biāo)記物溶液及各供試結(jié)果見圖5～圖7。

圖5 對照品溶液色譜圖Fig.5 Chromatogram of reference solution注:1:牛血清白蛋白,2:低分子肝素,3:血管緊張素,4:乙氨酰乙氨酰乙氨酸。

圖6 大豆分離蛋白溶液色譜圖Fig.6 Chromatogram of soybean protein solution

圖7 大豆肽溶液色譜圖Fig.7 Chromatogram of soybean peptide solution

由圖5可知,以四種對照品相對分子量的對數(shù)和保留時間做曲線,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-4.6982X+34.91,R2=0.9993,說明線性良好;依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,由圖6、圖7可知,大豆分離蛋白原液含有的蛋白質(zhì)及多肽的相對分子質(zhì)量主要區(qū)間在5000～1.0×105Da,在雙酶復(fù)合酶解下,酶解液的蛋白質(zhì)及多肽的相對分子質(zhì)量主要區(qū)間在500～4000 Da;即在雙酶的作用下,大豆分離蛋白的大分子蛋白質(zhì)成分酶解為小分子肽類,證明雙酶酶解效果明顯。

2.6各組間大鼠血壓變化

從表6中可以看出,造模前各組大鼠血壓無顯著性差異,造模后2周,模型對照組血壓仍持續(xù)升高,說明 L-NNA 誘發(fā)的高血壓病大鼠模型成功。與模型對照組相比,各組均有顯著性差異(p<0.05),大豆肽高劑量組與卡托普利組有極顯著性差異(p<0.01),即大豆肽高劑量組與卡托普利組效果相當(dāng)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)前期通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)法對菠蘿蛋白酶的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,在料液比1∶20 g/mL的情況下菠蘿蛋白酶在酶解溫度50 ℃,酶底比3.0%,酶解pH7.0條件下酶解2 h后,水解度為22.93%,對ACE抑制率較好為38.89%。對菠蘿蛋白酶與胰蛋白酶單酶酶解進(jìn)行對比研究可知胰蛋白酶酶解水解度稍低,但對ACE抑制率較好,在雙酶酶解過程中,先使用菠蘿蛋白酶酶解使大豆分離蛋白水解成適當(dāng)片段,胰蛋白酶作為人體重要的消化酶,在通過半仿生酶解不同切位點(diǎn)生成具有適宜片段的肽,從而提高對ACE的抑制率,然而胰蛋白酶酶解大豆分離蛋白的有效切位點(diǎn)還需要研究。從分子量分布圖譜可知雙酶酶解后的大豆肽分子量明顯降低,將超濾處理后的1000～3000 Da活性片段,通過體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)可得大豆肽與卡托普利組效果相當(dāng),但大豆肽的活性片段氨基酸的組成還需進(jìn)一步考察測定。

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