黑枸杞提取物對HBV的抑制作用及抗氧化能力測定

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(1.桂林醫(yī)學院藥學院,廣西桂林 541004;2.廣西肝臟損傷與修復分子醫(yī)學重點實驗室,廣西桂林 541004)

慢性乙型肝炎是乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染所導致的肝臟疾病,隨著疾病的進展,最終演變?yōu)楦喂δ墚惓?、肝硬化或甚至肝癌。全球乙肝病毒攜帶者有3.5～4億人,中國為乙型肝炎高流行區(qū),HBV攜帶者約有1.3億,慢性肝炎患者約3000萬人[1]。用以拉米夫啶、恩替卡韋等為代表的核苷類藥物抗乙肝病毒治療是目前臨床上公認的治療方案,但是長期用藥導致耐藥病毒株日益增多,HBV病毒學反彈,藥物治療不良反應多等現(xiàn)象[2]。肝臟的主要功能是代謝,但同時它也有著去氧化的作用。國內外研究表明肝臟負荷過大,去氧化能力下降導致肝臟被自由基損傷也與肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展有著很大的關系[3]。因而,尋求新的治療方案和開發(fā)更安全有效的藥物對患者進行抗炎保肝、抗病毒、清除自由基和免疫調節(jié)綜合治療是一種趨勢。

黑枸杞(LyciumruthenicumMurr)藏藥稱“旁瑪”,為茄科枸杞屬灌木植物,具棘刺,分布于我國西北地區(qū)[4]。研究發(fā)現(xiàn),黑枸杞有抗血脂、降血糖、免疫調節(jié)、延緩衰老、預防及治療心血管疾病的應用價值[5]。本實驗運用大孔吸附樹脂對黑枸杞分離提純,得到黑枸杞提取物[6],其提取物具有降低肝臟中脂肪含量及保肝[7]、抗腫瘤[8]、抗氧化活性[9]等多種藥理學效應。

研究顯示很多植物藥具有良好的抗乙肝功效,例如鹽酸千金藤堿[10]、綠茶兒茶素[11]、甘草提取液[12]、天花粉水提物[13]等多種天然藥物均有抗HBV作用,但黑枸杞提取物是否有抗乙肝作用尚未見報道。本實驗通過研究黑枸杞提取物對體外HepG22.2.15細胞模型分泌HBsAg和HbeAg的影響,從細胞水平上觀測和評價其抗HBV作用。并通過檢測黑枸杞提取物的·OH 的清除率、DPPH· 的清除率、還原能力來測定其抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

黑枸杞干果 購買于甘肅;DMEM高糖培養(yǎng)基、G418 美國Gibco公司;胎牛血清 奧地利PAA公司;谷氨酰胺 美國Sigma公司;HBsAg、HBeAg試劑盒 中國上海科華生物工程股份有限公司;MTT試劑盒 美國Amresco公司;HepG22.2.15細胞系 北京大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病毒研究所;拉米夫定 英國葛蘭素史克制藥有限公司;硫酸亞鐵、鐵氰化鉀 分析純,中國國藥集團化學試劑有限公司;氯化鐵、過氧化氫 分析純,中國西隴科學股份有限公司;抗壞血酸 中國山東佰仟化工有限公司;DPPH標準品 中國梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

二氧化碳培養(yǎng)箱 日本三洋公司;XSBIA倒置顯微鏡 中國上海蔡康光學儀器有限公司;超凈工作臺 中國天津塵埃凈化設備廠;細胞培養(yǎng)瓶、96孔細胞培養(yǎng)板 美國Corning公司;酶聯(lián)免疫檢測儀 美國BioTek公司;MVExc47/11-6液氮存貯灌 美國MVE公司。

1.2實驗方法

1.2.1 黑枸杞提取物的制備 稱取經干燥粉碎的黑枸杞粉末20 g,并按照固液比1∶10用55 ℃超純水浸提,過D101大孔樹脂,70%乙醇洗脫,-0.1 MPa下減壓回收乙醇并冷凍干燥得到黑色結晶粉末[14]。

1.2.2 黑枸杞提取物體外抗乙肝病毒實驗

1.2.2.1 細胞培養(yǎng)與藥物分組 培養(yǎng)基制備:DMEM 中加入380 mg·L-1G418,15%胎牛血清,2 mmol·L-1谷氨酰胺,1%青、鏈霉素,5%碳酸氫鈉并且調節(jié)pH7.2～7.4。HepG22.2.15細胞以1×104mL接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后加藥。黑枸杞提取物用培養(yǎng)基溶解,無菌過濾,稀釋為不同質量濃度:100、50、25、12.5 mg/L,分組加入96孔板中,在同等條件下,設無血清培養(yǎng)基并且不加黑枸杞提取物組為陰性對照組,拉米夫定組(終質量濃度100、50、25、12.5 mg/L)為陽性對照。加藥后每3 d收集上清液一次,再加入新的含藥培養(yǎng)基,共孵育9 d。收集的第3、6、9 d上清液于-20 ℃冰箱保存待測[15]。

1.2.2.2 黑枸杞提取物細胞毒性實驗(MTT法) 體外培養(yǎng)HepG22.2.15細胞用于檢測黑枸杞提取物的細胞毒作用。細胞接種于96孔板,每孔190 μL,加入藥物處理9 d。第9 d收集上清液后加入新的培養(yǎng)基190 μL,每孔加入20 μL MTT,37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱再培養(yǎng)4 h。棄掉上清液,每孔加入150 μL DMSO溶解孔內生成的MTT-甲瓚,用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長檢測各孔吸光度值,對各孔細胞生成的甲瓚進行定量。與對照組(細胞存活率100%)進行比較,計算出各孔細胞存活率,以判斷藥物的細胞毒性作用。

細胞存活率(%)=(實驗孔A值/對照孔A值)×100[16]

1.2.2.3 檢測黑枸杞提取物對HepG22.2.15細胞HBsAg和HBeAg表達的影響 根據(jù)雙抗體夾心ELISA試劑盒說明測定 HepG22.2.15細胞上清液HBsAg和HBeAg的表達。計算藥物對HBsAg和HBeAg分泌的抑制率。

抑制率(%)=(N-P)/(N-空白)×100

式中,N為陰性對照孔A值;P為實驗對照孔HbsAg或HbeAg的A值;空白為空白孔A值。

1.2.3 黑枸杞提取物的抗氧化活性的測定

1.2.3.1 不同濃度提取物對羥自由基(·OH)的清除能力測定 通過Fenten反應產生· OH,在試管中依次加入9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液100 μL,9 mmol/L的FeSO4100 μL,黑枸杞提取物分別配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/mL溶液不同濃度提取物100 μL,8.8 mmol/L H2O21 mL啟動整個反應。37 ℃水浴加熱15 min,然后離心機4000 r/min離心3 min。最后在510 nm下測定吸光度并設為A1。用100 μL蒸餾水代替FeSO4重復實驗得到A2,用100 μL去離子水代替提取物重復實驗得到A3。用抗壞血酸作為陽性對照,最后按下式計算羥基自由基的清除率:

·OH的清除率(%)=[A3-(A1-A2)]/A3×100

DPPH·的清除率(%)=[A3-(A1-A2)]/A3×100

1.2.3.3 不同濃度提取物還原能力的測定 黑枸杞提取物分別配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的溶液。將250 μL pH6.6磷酸鈉緩沖液(0.2 mol/L)和250 μL 1%的鐵氰化鉀溶液混合,取待測提取物溶液50 μL加到混合液中,在50 ℃條件下保溫20 min,加入250 μL 10%的三氯乙酸,3000 r/min離心10 min,最后取上清液250 μL,與250 μL 2.5 mL蒸餾水和100 μL 0.1%的氯化鐵混合,10 min后在700 nm下測定吸光值,用抗壞血酸作為陽性對照,吸光度值與還原能力呈正比例關系。

表2 黑枸杞提取物對HepG2 2.2.15細胞HBsAg表達的影響Table 2 Effects of black wolfberry extracts on HBsAg expression in HepG2 2.2.15 cells(±s,n=3)

注:與陰性對照組比較,*p<0.05;表3同。

1.3數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1黑枸杞提取物對HepG22.2.15細胞毒性作用

用MTT法檢測黑枸杞提取物對HepG22.2.15細胞增殖的影響。黑枸杞提取物孵育細胞9 d后,結果顯示黑枸杞提取物對HepG22.2.15細胞無細胞毒作用,各濃度細胞存活率均>100%,隨著濃度的增加細胞呈增生趨勢。而陽性對照組拉米夫啶在50～100 mg/L對HepG22.2.15細胞有一定毒性作用。提示黑枸杞提取物可促進HepG22.2.15細胞的增長,結果見表1。

表1 黑枸杞提取物對HepG22.2.15細胞的毒性作用(n=3)Table 1 Cytotoxic effects of black wolfberry extracts on HepG22.2.15 cells(n=3)

2.2黑枸杞提取物對HBsAg和HBeAg表達影響

黑枸杞提取物作用于細胞后,可抑制HepG22.2.15細胞HBsAg和HBeAg的分泌。黑枸杞提取物高濃度和中濃度對HepG22.2.15細胞HBsAg表達的抑制率呈遞增趨勢。高質量濃度100 mg/L第3、6、9 d對HBsAg的抑制率分別是8.20%、38.78%、53.22%。質量濃度50 mg/L第3、6、9 d對HBsAg的抑制率分別是-16.80%、-5.2%、11.53%,實驗結果分析說明,黑枸杞提取物在第9 d最高質量濃度100 mg/L對HepG22.2.15細胞HBsAg有抑制作用,其在質量濃度50 mg/L時對HepG22.2.15細胞HBsAg的表達抑制作用弱,前中期第3、6 d對HepG2 2.2.15細胞HBsAg的表達可能還有促進作用。陽性對照組拉米夫定對HBsAg和HBeAg表達的抑制作用弱,最高質量濃度100 mg/L第9 d對HBsAg和HBeAg抑制率為17.37%、27.10%,這與本實驗室以前的實驗結果[18]及李桂秋、劉江霞報道的結果一致[19-20]。結果見表2。

黑枸杞提取物高質量濃度和中質量濃度對HepG22.2.15細胞HBeAg表達的抑制率也呈遞增趨勢。最高質量濃度100 mg/L第3、6、9 d對HBeAg的抑制率分別是41.67%、60.45%、72.83%。在質量濃度50 mg/L第3、6、9 d對HBeAg的抑制率分別是13.34%、14.62%、47.31%,見表3。根據(jù)實驗結果分析說明黑枸杞提取物在第6、9 d最高質量濃度100 mg/L對HepG22.2.15細胞HBeAg的表達有明顯抑制作用,而在質量濃度50 mg/L時對HepG22.2.15細胞HBeAg的表達抑制作用弱,在質量濃度25 mg/L時,前中期第3、6 d對HepG22.2.15細胞HBeAg的表達可能還有促進作用。結果見表3。

2.3黑枸杞提取物的抗氧化活性

2.3.1 不同濃度提取物對羥自由基(·OH)的清除能力 由圖1可知,黑枸杞提取物濃度與抗壞血酸清除率呈正相關的關系。在相同濃度下,抗壞血酸對·OH的清除率要高于黑枸杞提取物對·OH 的清除率。抗壞血酸IC50值為1.501 mg/mL,黑枸杞提取物IC50值為26.559 mg/mL。圖1中黑枸杞提取物濃度為5.0 mg/mL時清除率最高,為21.07%。由此可知黑枸杞提取物有羥自由基清除能力,但在同等濃度條件下要低于陽性對照抗壞血酸。

表3 黑枸杞提取物對HepG22.2.15 細胞HBeAg表達的影響Table 3 Effects of black wolfberry extracts on HBeAg expression in HepG2 2.2.15 cells(±s,n=3)

圖1 黑枸杞提取物對羥自由基(·OH)的清除能力Fig.1 Scavenging effects on hydroxyl radical (·OH)of black wolfberry extracts

2.3.2 不同濃度提取物對DPPH自由基(DPPH·)清除能力 由圖2可知,黑枸杞提取物濃度的DPPH·的清除率較高。當黑枸杞提取物在0.05～0.15 mg/mL濃度范圍內時,其對DPPH·的清除能力明顯高于陽性對照抗壞血酸?？箟难酙C50值為0.276 mg/mL,圖中黑枸杞提取物濃度為0.30 mg/mL清除率最高,為97.25%。所以,黑枸杞提取物具有良好的清除DPPH·能力。

圖2 黑枸杞提取物對DPPH自由基(DPPH·)清除能力Fig.2 Scavenging effects on DPPH free radical(DPPH·)of black wolfberry extracts

2.3.3 不同濃度提取物的還原能力 由圖3可知,黑枸杞提取物的還原能力隨著濃度的增加而逐漸增強。但是在相同濃度下,抗壞血酸的還原能力要高于黑枸杞提取物對的還原能力。圖中黑枸杞提取物濃度為3.0 mg/mL時清除率最高,為1.440。因此黑枸杞提取物有還原能力,但同等濃度條件下要低于陽性對照抗壞血酸。

圖3 黑枸杞提取物的還原能力Fig.3 Reducing power of black wolfberry extracts

3 結論

在研究中發(fā)現(xiàn),黑枸杞提取物在體外對HepG22.2.15細胞沒有毒性作用,可抑制HepG22.2.15細胞HBsAg和HBeAg的表達,具有明顯的量效和時效關系。同時,黑枸杞提取物有清除·OH和DPPH·的能力和還原能力,隨著提取物濃度的增加其清除能力與還原能力逐漸增強。實驗結果與閆亞美等證實黑枸杞提取物抗氧作用基本一致[21]?；ㄇ嗨厥呛阼坭降挠行С煞趾统噬奈镔|[22],所以黑枸杞是天然的自由基清除劑,其抗氧化活性與花青素有關,對肝臟有一定的保護作用,其提取物抗病毒的有效成分和原理值得進行進一步研究。

本實驗中所用的陽性藥物拉米夫定主要是通過抑制HBV DNA的表達[12]發(fā)揮治療乙肝的作用,實驗數(shù)據(jù)顯示其對HepG22.2.15細胞中HBsAg和HBeAg的分泌抑制作用不強。本實驗結果與Kruining等[23]和WillIan等[24]報道拉米夫HepG22.2.15細胞中基本不影響HBsAg和HBeAg的分泌相同。在低濃度(12.5、25 mg/L)的時候,反而似乎有促進抗原表達的現(xiàn)象,但這現(xiàn)象隨著用藥時間的沿長,呈降低趨勢,在任衍菊等[25]的報道中也有類似現(xiàn)象?？紤]是藥物濃度相對低并且作用間短的情況下,受到細胞種板密度和細胞生長速度較快等因素影響造成。

綜上所述,黑枸杞提取物能抑制乙肝病毒,并且有著良好的抗氧化保肝作用,可在后續(xù)研究中進一步分離提取找到活性單體成分,探討其體內外抗HBV機制,為抗乙肝藥物研發(fā)提供參考。

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