明膠-殼聚糖-海藻酸鈉凝膠包埋木瓜蛋白酶的研究

, ,,,2,*

(1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京工商大學(xué),北京 100048;2.食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心,北京 100048)

海藻酸鈉是由1,4-聚-B-D-甘露糖醛酸和A-L-古羅糖醛酸構(gòu)成的線型聚合物,其具有無(wú)毒無(wú)害、不容易降解及生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。在溫和條件下,海藻酸鈉可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子的包埋[3]。殼聚糖分子構(gòu)成為(1,4)-2-氨基-2脫氧-β-D-葡萄糖胺,是天然多糖高分子材料[4],因其無(wú)毒、具有生物可降解性、生物活性等特性而具有廣泛應(yīng)用[5-6]。明膠是由膠原部分水解而得到的一類蛋白質(zhì),具有組織相容性、低抗原性、成膜性等優(yōu)良特性[7-8],為固定化酶的優(yōu)良載體[9]。用于固定化酶的天然高分子材料還有淀粉、甲殼素等[10]。因明膠、殼聚糖、海藻酸鈉來(lái)源廣泛、生物相容性好、成本低廉等優(yōu)點(diǎn),故選作本研究固定化酶的載體。

近年來(lái),使用復(fù)配材料逐漸成為固定化酶研究的熱門(mén)。張智等[11]利用海藻酸鈉、海藻酸鈉-明膠、海藻酸鈉-殼聚糖固定化磷脂酶,根據(jù)酶學(xué)特性得到最佳載體為海藻酸鈉-殼聚糖混合材料。陸兵等[12]對(duì)紅芝LYL263漆酶進(jìn)行不同凝膠體系的固定化研究發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉-殼聚糖-明膠固定化漆酶酶活最高。微膠囊作為固定化載體,擴(kuò)散性是一重要指標(biāo)[13]。有研究者指出有明膠參與的膠囊網(wǎng)孔更大,更有利于物質(zhì)的包埋和內(nèi)外物質(zhì)的擴(kuò)散[14]。但純明膠存在干燥后質(zhì)地脆、可被蛋白酶酶解[15]等缺點(diǎn),通常對(duì)明膠進(jìn)行改性處理以提高其穩(wěn)定性等性能。

本文分別使用明膠和改性明膠與殼聚糖、海藻酸鈉固定木瓜蛋白酶,以硬度和酶活為指標(biāo)進(jìn)行比較研究,評(píng)價(jià)了使用明膠和改性明膠對(duì)固定化木瓜蛋白酶的影響,為固定化木瓜蛋白酶提供了一種新思路。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

海藻酸鈉、殼聚糖、明膠、無(wú)水CaCl2、鹽酸、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、無(wú)水碳酸鈉、三氯乙酸、25%溶液戊二醛 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;木瓜蛋白酶(活力4.96×105U/g)、福林酚試劑、三羥甲基氨基甲烷 Sigma公司;干酪素 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;L-酪氨酸 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;L-谷胱甘肽 拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

CP214電子天平 上海市奧豪斯儀器有限公司;pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;CT-3質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)Brookfield公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;DF-101S恒溫磁力攪拌鍋 河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;超聲波清洗機(jī) 南京先歐生物科技有限公司;UVmini-1240紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 明膠/改性明膠-殼聚糖-海藻酸鈉對(duì)木瓜蛋白酶的包埋

1.2.1.1 明膠-殼聚糖-海藻酸鈉對(duì)木瓜蛋白酶的包埋 稱取一定質(zhì)量的明膠、殼聚糖、海藻酸鈉,溶于100 mL一定pH0.1 mol/L的Tris-鹽酸緩沖液中,磁力攪拌30 min至完全溶解，冷卻至室溫后取20 mL。然后加入0.01 g木瓜蛋白酶,攪拌均勻。用一次性滴管將上述攪拌均勻的溶液緩慢滴入一定濃度的CaCl2中,形成凝膠球。放入4 ℃冰箱儲(chǔ)存,30 min后將凝膠球撈出,用去離子水反復(fù)洗凈,濾干,用于測(cè)定酶活。

為便于測(cè)定凝膠球硬度,將其制備成相應(yīng)的凝膠塊,在燒杯中加入5 mL一定濃度CaCl2溶液鋪滿燒杯底部,取80 mL凝膠液迅速倒入其中,然后沿?zé)诰徛尤隒aCl2溶液,可制得凝膠塊(厚(1.3±0.1) cm),放入4 ℃冰箱,24 h后測(cè)硬度。

1.2.1.2 改性明膠-殼聚糖-海藻酸鈉對(duì)木瓜蛋白酶的包埋 采用前人研究的結(jié)果[16],使用明膠抗水解能力強(qiáng)的條件改性明膠:稱取4 g明膠溶于20 mL、pH6的PBS緩沖液,溶解后加入0.9%戊二醛改性16 min。得到改性明膠溶液,改性明膠濃度為0.2 g/mL。

稱取殼聚糖與海藻酸鈉粉末,溶于一定體積一定pH的Tris-鹽酸緩沖液,加入相應(yīng)體積的改性明膠,磁力攪拌30 min至完全溶解，冷卻至室溫后取20 mL加入0.01 g木瓜蛋白酶,攪拌均勻。用一次性滴管將上述攪拌均勻的溶液緩慢滴入一定濃度的CaCl2中,形成凝膠球,放入4 ℃冰箱儲(chǔ)存,30 min后將凝膠球撈出,用去離子水反復(fù)洗凈,濾干,用于測(cè)定酶活。

為便于測(cè)定凝膠球硬度,將其制備成相應(yīng)的凝膠塊,在燒杯中加入5 mL一定濃度CaCl2溶液鋪滿燒杯底部,取80 mL凝膠液迅速倒入其中,然后沿?zé)诰徛尤隒aCl2溶液,制得凝膠塊(厚(1.3±0.1) cm),放入4 ℃冰箱,24 h后測(cè)硬度。

1.2.2 明膠/改性明膠-殼聚糖-海藻酸鈉固定木瓜蛋白酶單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 不同質(zhì)量濃度組成對(duì)包埋木瓜蛋白酶的影響 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)成球效果確定明膠/改性明膠-殼聚糖-海藻酸鈉的質(zhì)量濃度見(jiàn)表1,其中固定CaCl2濃度為0.6 mol/L,Tris-鹽酸緩沖液pH7。

表1 明膠/改性明膠-殼聚糖-海藻酸鈉的質(zhì)量濃度Table 1 Gelatin/modified gelatin-chitosan-sodium alginate concentration

1.2.2.2 CaCl2濃度對(duì)包埋木瓜蛋白酶的影響 用0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol/L的不同濃度的CaCl2溶液,其中固定明膠、改性明膠質(zhì)量濃度均為0.3%、殼聚糖質(zhì)量濃度為0.3%、海藻酸鈉質(zhì)量濃度為2.4%,Tris-鹽酸緩沖液pH7。

1.2.2.3 緩沖液pH對(duì)包埋木瓜蛋白酶的影響 使用pH6、6.5、7、7.5、8的Tris-鹽酸緩沖液,其中固定明膠、改性明膠質(zhì)量濃度均為0.3%、殼聚糖質(zhì)量濃度為0.3%、海藻酸鈉質(zhì)量濃度為2.4%,CaCl2濃度0.6 mol/L。

表2 使用明膠/改性明膠的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels table for the trial of gelatin/modified gelatin

1.2.3 明膠/改性明膠-殼聚糖-海藻酸鈉固定木瓜蛋白酶優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選擇較優(yōu)變化的范圍,確定相應(yīng)的水平,最終確定均勻優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案,選取明膠/改性明膠質(zhì)量濃度、殼聚糖質(zhì)量濃度、海藻酸鈉質(zhì)量濃度、CaCl2濃度、以及緩沖液pH五個(gè)因素。綜合考慮硬度酶活兩個(gè)指標(biāo),利用DPS軟件設(shè)計(jì)均勻?qū)嶒?yàn)優(yōu)化方案見(jiàn)表2。

1.2.4 酶活力測(cè)定方法 參照福林酚法測(cè)酶活[17-18]酶活力單位定義為在1 min內(nèi)催化酪蛋白水解生成1 μg酪氨酸的酶量為一個(gè)活力單位(U)。固定化酶活力單位根據(jù)載體質(zhì)量以U/g表示。

1.2.5 硬度測(cè)定方法 參照bloom法[19],使用CT-3質(zhì)構(gòu)儀,測(cè)定條件為:柱塞P0.5;壓力5 g,速度1 mm/s。每個(gè)樣品作三個(gè)平行樣,重復(fù)測(cè)定三次取平均值。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)各值均為三個(gè)平行數(shù)據(jù)的均值。采用DPSv15.10數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果與分析應(yīng)用 Microsoft Excel 2007、Origin 9.0和SPSS 22.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1明膠/改性明膠-殼聚糖-海藻酸鈉共混固定木瓜蛋白酶單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同質(zhì)量濃度組成對(duì)包埋木瓜蛋白酶的影響 結(jié)果分別見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 三種組成成分對(duì)硬度的影響Fig.1 Effect of the three components on the hardness

根據(jù)圖1得出使用改性明膠與使用明膠相比對(duì)硬度的影響無(wú)顯著性差異,這與體系中明膠的量較少,硬度主要受海藻酸鈉的影響有關(guān)。由圖2可知,一定組成的明膠、殼聚糖和海藻酸鈉包埋可以提高酶活,使用明膠制備得到第5組酶活最大。使用改性明膠第6組酶活最大。根據(jù)此結(jié)果同時(shí)考慮到三種物質(zhì)組成的體系復(fù)雜,三者相互作用未知,優(yōu)化實(shí)驗(yàn)選擇相應(yīng)物質(zhì)的濃度范圍進(jìn)行優(yōu)化,確定明膠濃度范圍0.15%～0.45%,殼聚糖濃度范圍0.15%～0.45%,海藻酸鈉濃度范圍2.25%～2.55%;改性明膠濃度范圍0.15%～0.45%,殼聚糖濃度范圍0.15%～0.45%,海藻酸鈉濃度范圍2.25%～2.55%。第4、5組使用明膠的酶活顯著高于使用改性明膠的酶活(p<0.05),6、8、9、10組使用改性明膠酶活顯著提高(p<0.05)。酶活變化情況復(fù)雜分析原因與體系的復(fù)雜組成有關(guān),海藻酸鈉是固定化酶顆粒成球的主要因素,濃度較低時(shí),表面形成的固定化膜強(qiáng)度不夠,容易分離,造成酶活力低。當(dāng)海藻酸鈉濃度過(guò)高時(shí),顆粒表面結(jié)構(gòu)致密膜強(qiáng)度高,造成酶活降低。殼聚糖濃度過(guò)高也會(huì)使固定化顆粒表面膜致密,造成底物擴(kuò)散困難,降低酶活[20]。明膠濃度影響凝膠結(jié)構(gòu)的孔徑[21],適宜濃度的明膠可以提高酶活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一定組成條件下明膠改性后可提高酶活。推測(cè)明膠改性后發(fā)生變化,與殼聚糖-海藻酸鈉之間產(chǎn)生影響,對(duì)其固定化酶結(jié)構(gòu)或酶產(chǎn)生了影響。

2.1.2 CaCl2濃度對(duì)包埋木瓜蛋白酶的影響 結(jié)果分別見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 CaCl2濃度對(duì)硬度的影響Fig.3 Effect of CaCl2 concentration on hardness

圖4 CaCl2濃度對(duì)酶活的影響Fig.4 Effect of CaCl2 Concentration on enzyme activity

由圖3可以得出,凝膠硬度隨CaCl2濃度上升而提高,使用改性明膠和使用明膠相比硬度無(wú)顯著性差異。由圖4得到酶活隨CaCl2濃度增大先增大后減小。Yen[22]利用海藻酸鈉膠囊固定化米根霉研究發(fā)現(xiàn)CaCl2增會(huì)增加固定化膠囊的厚度,增加傳質(zhì)阻力。CaCl2濃度增大可能增加酶擴(kuò)散阻力,導(dǎo)致CaCl2濃度增加酶活降低。有研究者研究得到CaCl2濃度高不利于酶活[19]。

表3 使用明膠均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果表Table 3 Uniform experimental results of gelatin

解釋為當(dāng)CaCl2較高時(shí),鈣離子會(huì)布滿凝膠表面,影響酶的作用,從而不利于酶活。使用改性明膠后酶活提高,改性后明膠抗酶解能力顯著增強(qiáng)[15],明膠更好發(fā)揮其作用,更有利于物質(zhì)的包埋和內(nèi)外物質(zhì)的擴(kuò)散[13]。改性明膠酶活最大值18.99 U/g,使用明膠最大酶活12.51 U/g,使用改性明膠與明膠相比提高了52%。

2.1.3 pH對(duì)對(duì)包埋木瓜蛋白酶的影響 結(jié)果分別見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 pH對(duì)硬度的影響Fig.5 Effect of pH on hardness

圖6 pH對(duì)酶活的影響Fig.6 Effect of pH on enzyme activity

由圖5可知,硬度在pH7.5時(shí)出現(xiàn)最大值。黃正華等[23]研究海藻酸鈉殼聚糖凝膠,pH7時(shí)凝膠硬度達(dá)到最大。趙謀明等[24]研究表明,離子強(qiáng)度明顯影響海藻酸鈉和明膠的相互作用,推出明膠與海藻酸鈉主要為靜電力作用。pH過(guò)低時(shí),海藻酸鈉含量多,帶負(fù)電荷少起作用,使三者靜電作用力小硬度低。pH過(guò)高,海藻酸鈉相互間存在斥力,明膠-殼聚糖與海藻酸鈉靜電吸引作用小,硬度下降。使用改性明膠與使用明膠的結(jié)果對(duì)比,在pH6.5、7.5時(shí),明膠改性后硬度降低了25%、20%,孫言蓓等[25]利用乙二胺改性,使得明膠部分基團(tuán)發(fā)生變化,氨基增加,使得明膠溶液黏度降低。在pH6.5、7.5明膠改性后可能對(duì)體系粘度產(chǎn)生影響從而使得硬度發(fā)生改變。圖6結(jié)果表明,酶活隨pH先增大后減小,pH7時(shí)酶活最大。游離木瓜蛋白酶最適合pH7,固定化后最適合pH未改變。使用改性明膠酶活最大值21.66 U/g,使用明膠酶活最大值14.67 U/g,使用改性明膠使酶活提高了48%。

2.2明膠/改性明膠-殼聚糖-海藻酸鈉固定木瓜蛋白酶優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)DPS軟件設(shè)計(jì)均勻?qū)嶒?yàn)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用明膠和改性明膠結(jié)果分別如表3、表4所示,采用偏最小二乘回歸分析方法對(duì)混合水平均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。得到最優(yōu)條件:明膠質(zhì)量濃度0.45%,殼聚糖質(zhì)量濃度0.42%,海藻酸鈉質(zhì)量濃度2.55%,CaCl2濃度0.8 mol/L,緩沖液pH7.5;改性明膠質(zhì)量濃度0.45%,殼聚糖質(zhì)量濃度0.15%,海藻酸鈉質(zhì)量濃度2.55%,CaCl2濃度0.8 mol/L,緩沖液pH6.5。

表4 使用改性明膠均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果表Table 4 Uniform experimental results of modified gelatin

表5 理論值與實(shí)測(cè)結(jié)果比較Table 5 Comparison of theoretical values with measured results

在最優(yōu)條件下進(jìn)行兩組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),將得到的實(shí)際值與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)得到的預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較,如表5所示。使用明膠酶活相對(duì)誤差3.68%,硬度相對(duì)誤差9.25%;使用改性明膠酶活相對(duì)誤差8.30%,硬度相對(duì)誤差7.30%。數(shù)據(jù)系統(tǒng)分析模型的理論值與實(shí)測(cè)值相比可以說(shuō)明預(yù)測(cè)模型具有一定的指導(dǎo)意義。對(duì)比使用改性明膠與使用明膠的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用改性明膠后殼聚糖濃度、緩沖液pH更低,其他得到的優(yōu)化條件相同。對(duì)比采用優(yōu)化條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到的酶活和硬度的結(jié)果,與使用明膠相比,使用改性明膠的酶活提高37%,硬度減少35%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,通過(guò)均勻?qū)嶒?yàn),確定兩組最佳條件:明膠質(zhì)量濃度0.45%,殼聚糖質(zhì)量濃度0.42%,海藻酸鈉質(zhì)量濃度2.55%,CaCl2濃度0.8 mol/L,緩沖液pH7.5。改性明膠質(zhì)量濃度0.45%,殼聚糖質(zhì)量濃度0.15%,海藻酸鈉質(zhì)量濃度2.55%,CaCl2濃度0.8 mol/L,緩沖液pH6.5。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)建立的模型具有一定指導(dǎo)意義。使用改性明膠可提高酶活,但硬度降低,與明膠相比酶活提高37%,硬度減少35%。

固定化木瓜蛋白酶的硬度和酶活受明膠、殼聚糖、海藻酸鈉、CaCl2濃度和緩沖液pH等多種因素的影響。在今后的研究中,可以根據(jù)不同的研究目的選擇使用明膠還是改性明膠,如考慮提高酶活,可以使用改性明膠。雖然目前對(duì)明膠、殼聚糖、海藻酸鈉相互作用形成凝膠有一定的認(rèn)識(shí),但還不夠深入,在機(jī)理等方面還有待于進(jìn)一步的研究和探索。

[1]候麗云.脂肪酶固定化及其在催化合成乙酸香茅酯中的應(yīng)用研究[D].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2013.

[2]Yang J S,Xie Y J,He W. Research progress on chemical modification of alginate:A review[J]. Carbohydrate Polymers,2011,84(1):33-39.

[3]劉麗英,王圣潔.海藻酸鈣凝膠微球的制備和pH敏感釋放[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(42):8303-8306.

[4]曹健.食品酶學(xué)[M].鄭州:鄭州大學(xué)出版社,2011:111-122.

[5]Rinaudo M. Chitin and chitosan:Properties and applications[J]. Cheminform,2007,38(7):603-632.

[6]黃程,蔡林林,童曉倩,等.殼聚糖固定化胃蛋白酶的工藝優(yōu)化及穩(wěn)定性研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2017(1):118-125.

[7]徐淑霞,趙培,杜文濤,等.明膠與海藻酸鈉協(xié)同固定GOD特性的研究[J]. 河南科學(xué),2015(12):2111-2116.

[8]Duconseille A,Astruc T,Quintana N,et al. Gelatin structure and composition linked to hard capsule dissolution:A review[J]. Food Hydrocolloids,2015,43(43):360-376.

[9]魏坤銳,阮如玉.明膠固定化酶的研究進(jìn)展[J].明膠科學(xué)與技術(shù),2014,34(1):9-13.

[10]李麗娟,馬貴平,趙林果.固定化酶載體研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程志,2015,35(11):105-113.

[11]張智,王瑾,王騰宇,等.磷脂酶固定化方法的研究[J].中國(guó)油脂,2009(9):35-38.

[12]陸兵,諶斌,易小暢,等.紅芝LYL263所產(chǎn)漆酶在溶膠-凝膠體系中的固定化研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(10):5776-5778.

[13]Dembczynski R,Jankowski T. Characterisation of small molecules diffusion in hydrogel-membrane liquid-core capsules[J]. Biochemical Engineering Journal,2000,6(1):41-44.

[14]張國(guó)睿,雷愛(ài)祖,童張法.海藻酸鈉明膠協(xié)同固定化酵母生產(chǎn)ATP[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2008,34(4):16-20.

[15]孟歡,羅儒顯.木瓜蛋白酶水解明膠制備多肽的工藝研究[J].廣東化工,2010(1):36-38.

[16]張單單,白鴿,王琳,等.戊二醛改性明膠耐酶解條件的優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2016,37(6)：133-136，141.

[17]劉平,胡志和,吳子健,等.超高壓處理菠蘿蛋白酶引發(fā)構(gòu)象變化與酶活力的關(guān)系[J].食品科學(xué),2014,35(21):

138-142.

[18]高英,俞玉忠.福林酚法測(cè)定腦蛋白水解物溶液中的多肽含量[J].海峽藥學(xué),2004,16(6):57-58.

[19]夏雨,焦志華,劉海英.茶多酚對(duì)明膠的改性作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2011(10):36-40.

[20]李曉靜,韓宗元,侯俊財(cái).海藻酸鈉-殼聚糖固定化堿性蛋白酶的研究[J].食品工業(yè),2015(6):54-61.

[21]李曉卉,程麗芳,沐萬(wàn)孟,等.交聯(lián)海藻酸鈉-明膠固定化L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2011(8):198-201.

[22]Yen H W. Production of lactic acid from raw sweet potato powders by rhizopus oryzae immobilized in sodium alginate capsules.[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2010,162(2):607-615.

[23]黃正華,曹雁平,許朵霞,等.成膠條件對(duì)殼聚糖-海藻酸凝膠硬度的影響[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2015,15(2):163-167.

[24]趙謀明,李敏,孫哲浩,等.明膠與海藻酸鈉的相互作用及其應(yīng)用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2000(3):10-14.

[25]孫言蓓.新型海藻酸鹽-明膠水凝膠的研究[D].天津:天津大學(xué),2007.