凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)親蝦繁殖期水體微生物多樣性*

陳 瓊 李貴陽, 羅 坤, 孔 杰,① 莫照蘭,欒 生, 李 杰, 曹寶祥, 張玉玲

(1. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 青島 266003; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點開放實驗室 青島 266071; 3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071)

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei), 俗稱南美白對蝦, 具有生長迅速、個體大、營養(yǎng)要求較低、抗病性較強、對水環(huán)境變化適應(yīng)強等特點。1988年我國引進凡納濱對蝦, 目前在全國各地廣泛養(yǎng)殖(王興強等, 2004)。隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的深入發(fā)展, 養(yǎng)殖集約化日益加深, 大量的殘餌和糞便導(dǎo)致養(yǎng)殖水體惡化, 各種病害頻發(fā), 嚴(yán)重制約了對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。養(yǎng)殖水體是水產(chǎn)動物賴以生存的環(huán)境, 水體中的微生物在養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中發(fā)揮著巨大作用(鄭天凌等, 1994)。細(xì)菌是水體中的主要微生物類群, 對于對蝦而言, 養(yǎng)殖水體中氣單胞菌(Aeromonas)和假單胞菌(Pseudomonadaceae)保持一定數(shù)量時, 有利于對蝦生長; 而一些弧菌(Vibrio)、單胞菌、假單胞菌等大量存在時, 可導(dǎo)致對蝦患病。有研究表明, 養(yǎng)殖水體中弧菌數(shù)量達到 105indi./mL以上時, 可能會引發(fā)弧菌病(朱根福等, 1999)。一些有益微生物, 如乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)和酵母菌(Yeast)等數(shù)量增多, 也可以改善養(yǎng)殖水環(huán)境質(zhì)量,為高效、高產(chǎn)的對蝦養(yǎng)殖奠定基礎(chǔ)。因此, 了解對蝦養(yǎng)殖水體的微生物組成, 對養(yǎng)殖水環(huán)境進行監(jiān)控, 通過人為調(diào)控養(yǎng)殖水體微生物菌群結(jié)構(gòu)來保持水體的微生態(tài)平衡, 可以為人們提供綠色健康的養(yǎng)殖模式。1986年, Kozasa首次將分離自土壤的 1株芽孢桿菌(Bacillus)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖(Kozasa, 1986)。目前, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已經(jīng)認(rèn)識的有益微生物有光合細(xì)菌(Photosynthetic Bacteria Abbr, PSB)、芽孢桿菌、酵母菌等, 這些有益微生物在調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體質(zhì)量、促進養(yǎng)殖生物生長、提高養(yǎng)殖生物抗病性等方面發(fā)揮著重要作用。

由于大多數(shù)環(huán)境微生物在常規(guī)培養(yǎng)基上無法生長, 故傳統(tǒng)的培養(yǎng)法只能分離和鑒定總微生物量的0.1%—10%(Torsvik et al, 1998)?；谶M化中相對保守的核酸分子序列的分析技術(shù)逐漸用于研究環(huán)境微生物多樣性(Pace et al, 1997)。例如, 通過變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(Temperature Gradient Gel Electrophoresis, TGGE)等分析16S rRNA基因序列的點突變來反應(yīng)環(huán)境樣品的微生物多樣性。如, 王亭芳等(2012)采用DGGE技術(shù)對凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體中的微生物多樣性進行研究; 高平平等(2003)采用 TGGE技術(shù)研究廢水處理系統(tǒng)活性污泥細(xì)菌種群動態(tài)變化及多樣性。但這些傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)存在重復(fù)性較差、無法定量分析、信息不全等缺陷, 故對環(huán)境中絕大部分微生物的發(fā)掘仍不全面(祎李, 2013)。高通量測序技術(shù)(High-throughput sequencing, HTS), 又稱為“下一代”測序(next generation sequencing, NGS)技術(shù), 可以一次分別對幾百萬至上千萬條 DNA進行測序(Shendure et al, 2008), 它的迅速發(fā)展彌補了傳統(tǒng)分子生物學(xué)的不足, 能更加全面的反映樣品的微生物多樣性。高通量測序法具有測序成本低, 測序深度高, 更有利于低豐度群落物種鑒定的優(yōu)點, 從而提高了微生物群落研究的完整性。

在凡納濱對蝦育苗時期, 對親蝦的管理至關(guān)重要, 親蝦養(yǎng)殖水體中致病微生物達到一定數(shù)量則會使蝦患病, 從而降低生產(chǎn)。養(yǎng)殖水體微生物多樣性的研究可以對水體質(zhì)量進行評價, 為及時采取措施調(diào)控水體微生態(tài)平衡提供條件。為了深入了解凡納濱對蝦繁殖時期親蝦養(yǎng)殖水體的微生物群落結(jié)構(gòu), 本實驗采用Illumina HiSeq2500測序平臺, 對凡納濱對蝦親蝦養(yǎng)殖水體微生物 16S rRNA基因的兩個高變區(qū)(V3-V4區(qū))進行測序分析, 從而更全面地分析親蝦養(yǎng)殖水體中的微生物群落組成, 不僅可以為親蝦繁殖期的健康養(yǎng)殖提供理論支持, 還為我們尋找具有特殊功能的微生物菌種提供豐富的生物資源。

1 材料與方法

1.1 水樣采集和預(yù)處理

水樣采自于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所水產(chǎn)遺傳育種中心(山東省青島市即墨鰲山衛(wèi))的凡納濱對蝦親蝦養(yǎng)殖池。養(yǎng)殖水泥池的面積為9m2, 池深1.2m, 水深約為0.6m。蝦池每天上午換水一次, 換水量為總水量的 2/3, 對蝦按時投喂經(jīng)高錳酸鉀消毒處理的鮮活沙蠶(Sipunculus nudus), 日投喂量為體重的30%。取樣時水樣溫度為26°C, 鹽度為35(W/V)。選取雄蝦池(A7池, 42尾)、雌蝦池(A8池, 37尾)進行水樣采集。每池各選取水深為0.2m處的3個不同的采樣點, 于2015年10月23日上午8時, 用采樣器取每個取樣點水 2L于滅菌的三角燒瓶中, 編號分別為A7(X1.1、X2.2、X3.2)、A8(C1.2、C2.2、C3.2)。所有樣品迅速運回實驗室并保存在4°C條件下, 及時用孔徑為0.22μm的醋酸纖維素濾膜過濾收集水體中的微生物。將過濾好的濾膜保存在滅菌的50mL離心管中, 并保存在-20°C條件下, 用于微生物宏基因組DNA的提取。

1.2 水樣微生物宏基因組DNA的提取

水樣微生物宏基因組DNA的提取采用酚氯仿法和細(xì)菌基因組提取試劑盒(艾德萊,北京)。具體為: 剪碎濾膜, 放入 1.5mL無菌離心管中, 加 600μL無菌STE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl, 100mmol/L NaCl,1mmol/L EDTA, pH8.0)混勻, 渦旋 1min。加 60μL 溶菌酶, 渦旋 10s, 置于 37°C 水浴鍋水浴 30min, 每10min搖晃一次。加入 60μL 10%的 SDS, 混勻, 加6μL蛋白酶K, 渦旋10s, 65°C水浴20min, 每10min搖晃一次。1400g條件下離心15min, 吸取上清液于新的離心管中。加600μL 酚 ∶ 氯 仿 ∶ 異戊醇(25∶24∶1), 混勻后在 15294g轉(zhuǎn)速下離心 10min。吸取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管, 加 600μL 酚 ∶ 氯 仿 ∶ 異戊醇(25∶24∶1), 混勻后在 15294g轉(zhuǎn)速下離心 10min,重復(fù)此步驟兩次。加入2倍體積無水乙醇, -20°C過夜。之后采用細(xì)菌基因組提取試劑盒的方法過柱處理。提取好的 DNA采用 Nanodrop 2000(Thermo Fisher, 美國)測定其濃度, 將合格樣品(OD260/280=1.8—2.0, 濃度≥50ng/μL, 總量≥2μg)送至諾禾致源公司(北京)進行高通量測序。

1.3 PCR擴增及擴增產(chǎn)物的純化

取適量 DNA于離心管中, 使用無菌水稀釋樣品至 1ng/μL, 以稀釋后的基因組 DNA為模板, 選擇加入Barcode 標(biāo)簽的341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和 805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)作為引物,利用高效高保真酶(New England Biolabs, NEB)擴增16S rRNA基因V3-V4區(qū)。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測; 根據(jù) PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣, 充分混勻后使用 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測混合的PCR產(chǎn)物, 利用膠回收試劑盒(QIAGEN)對目的條帶進行回收。

1.4 文庫構(gòu)建和上機測序

使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒(Illumina)進行文庫構(gòu)建, 構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量, 使用HiSeq2500(諾禾致源公司, 北京)進行測序。

1.5 測序數(shù)據(jù)的處理與分析

1.5.1 高通量序列的處理 采用 Illumina HiSeq測序平臺得到原始數(shù)據(jù)(raw data), 然后進行拼接和質(zhì)控, 得到有效數(shù)據(jù)(clean data), 再進行嵌合體過濾,得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)(effective tags)。然后,基于有效數(shù)據(jù)進行OTUs(operational taxonomic units)聚類。

1.5.2 統(tǒng)計分析 利用 Uparse軟件對所有樣品的全部effective tags進行聚類, 以97%的一致性將序列聚類成OTUs。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果, 對每個OTU的代表序列做物種注釋, 得到對應(yīng)的物種信息, 根據(jù)物種注釋結(jié)果, 選取每個樣品在門、綱、目、科、屬 5個分類級別上最大豐度排名前 10的物種, 生成物種相對豐度柱形累加圖。分別統(tǒng)計了雌雄蝦養(yǎng)殖水體的所有樣品中均存在的 OTU, 找出其核心微生物菌群(core microbiome, 指兩個或多個與某一特定環(huán)境相關(guān)的微生物集群中所共有的成員)(Turnbaugh et al,2007)。從物種分類信息和樣品間差異兩個層面進行聚類并繪制成熱圖(heatmap)。采用熱圖對核心微生物群在各分類水平上進行可視化展示。進一步對OTUs進行豐度分析、α-多樣性(alpha diversity)和β-多樣性計算等, 以得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息等。α-多樣性用于分析樣品內(nèi)的微生物群落多樣性(Holmstr?m et al,1999), 通過單樣本的多樣性分析可以反映樣品內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性。使用Qiime軟件(Version 1.7.0)計算 α-多樣性指數(shù), 包括Observed-species, Shannon, Simpson, Chao1, ACE,Goods-coverage指數(shù)。對不同樣品在97%一致性閾值下的 α-多樣性分析指數(shù)進行統(tǒng)計。β-多樣性研究中,基于weighted unifrac距離和unweighted unifrac距離進行了主坐標(biāo)分析(Principal Coordinates Analysis,PCoA)分析, 并選取貢獻率最大的主坐標(biāo)組合進行作圖展示。LEfSe(LDA Effect Size)分析能夠在組與組之間尋找具有統(tǒng)計學(xué)差異的 Biomarker(Segata et al,2011), 即組間差異顯著的物種。利用LEfSe軟件進行數(shù)據(jù)分析, 并采用 LDA值分布柱狀圖和進化分支圖(系統(tǒng)發(fā)育分布)來展示LEfSe的統(tǒng)計結(jié)果。為進一步挖掘分組樣品間的群落結(jié)構(gòu)差異, 選用 T-test、Metastats、Anosim和MRPP等統(tǒng)計分析方法對分組樣品的物種組成和群落結(jié)果進行差異顯著性檢驗。同時, 結(jié)合環(huán)境因素進行CCA/RDA分析和多樣性指數(shù)與環(huán)境因子的相關(guān)性分析, 得到顯著影響組間群落變化的環(huán)境影響因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序數(shù)據(jù)

從雌雄蝦池獲取的6個水樣(X1.1、X2.2、X3.2、C1.2、C2.2、C3.2))經(jīng)過Illumina HiSeq2500平臺測序后分別得到各自的下機數(shù)據(jù)Raw PE, 經(jīng)過拼接和質(zhì)控后得到 Clean Tags, 經(jīng)過嵌合體過濾后得到 Effective Tags。6個水樣經(jīng)高通量測序后共得到230398條可用于分析的序列, 包含4603條頻數(shù)為1且無法被聚類到OTUs的序列, 3條沒有獲得注釋信息的序列和225792條可用于構(gòu)建 OTUs并且獲得注釋信息的序列。以97%的一致性, 將每個樣品所得的序列聚類成 OTU,其中雄蝦池3個樣品的平均OTU數(shù)目為396; 雌蝦池3個樣品的平均OTU數(shù)目為475。根據(jù)物種注釋情況,統(tǒng)計每個樣品注釋到各分類水平上的序列數(shù)目, 在門、綱、目、科、屬、種 6個水平上, 雄蝦養(yǎng)殖水體序列數(shù)分別平均為 41583、41463、411494、40709、2496和 148條; 雌蝦養(yǎng)殖水體序列數(shù)分別平均為33578、33512、32981、32295、7823和113條。

2.2 雌雄蝦養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落特征

2.2.1 物種相對豐度展示 對于雄蝦養(yǎng)殖水體,優(yōu)勢門中變形菌門 (Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度分別為76.15%、21.28%和1.65%; 優(yōu)勢綱中α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、Saprospirae、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、Flavobacteriia和放線菌綱(Actinobacteria)的相對豐度分別為73.11%、19.89%、2.30%、1.29%和 1.42%; 優(yōu)勢目中紅桿菌目(Rhodobacterales)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、放線菌目(Actinomycetales)和黃桿菌目(Flavobacteriales)的相對豐度分別為71.24%、19.89%、1.42%和1.29%;優(yōu)勢科中紅桿菌科(Rhodobacteraceae)和腐螺旋菌科(Saprospiraceae)的相對豐度分別為71.20%和19.89%;優(yōu)勢屬Pseudoruegeria和Marivita的相對豐度分別為2.02%和 1.43%。對于雌蝦養(yǎng)殖水體, 優(yōu)勢門變形菌門、擬桿菌門和放線菌門的相對豐度分別為66.01%、29.02%和3.82%; 優(yōu)勢綱中α-變形菌綱、Saprospirae、Flavobacteriia、γ-變形菌綱和放線菌綱的相對豐度分別為 58.93%、19.14%、9.14%、5.51%和 3.48%; 優(yōu)勢目中紅桿菌目、腐螺旋菌目、黃桿菌目和放線菌目的相對豐度分別為53.87%、19.14%、9.14%和3.48%;優(yōu)勢科中紅桿菌科、腐螺旋菌科、Cryomorphaceae的相對豐度分別為53.76%、19.11%和4.87%; 優(yōu)勢屬Pseudoruegeria、Marivita、HTCC2207和 Sediminicola的相對豐度分別為8.41%、5.33%、2.03%和1.80%。圖1是選取門(圖1a)和屬(圖1b)水平最大豐度排名前10的物種生成的物種相對豐度柱形圖, 從圖中可知,雌雄蝦養(yǎng)殖水體中豐度最高的 2個門均是變形菌門和擬桿菌門, 豐度最高的2個屬均是Pseudoruegeria和 Marivita。

表1 Tags和OTUs數(shù)目統(tǒng)計表Tab. 1 Tags and OTUs number

圖1 樣品在門水平(a)和屬水平(b)物種相對豐度Fig. 1 Relative abundance of species in phylum (a) and genus (b) level注: Others表示圖中這10個門(屬)之外的其他所有門(屬)的相對豐度之和。

2.2.2 核心微生物群落 核心微生物分析表明,雌雄蝦養(yǎng)殖水體的核心OTU數(shù)目分別為475和396。圖2是核心微生物群在屬水平上的熱圖。從圖中可以看出, 雌雄蝦養(yǎng)殖水體的核心微生物群(屬水平)明顯不同。雄蝦養(yǎng)殖水體的核心屬主要包括Glaciecola、Octadecabacter、Methylobacterium、Psychroserpens、Olleya; 雌蝦養(yǎng)殖水體的核心屬主要包括Thalassomonas、Thalassobius、Marinicella、Fluviicola、Sediminicola、Marivita、Pseudoruegeria、HTCC2207、Pseudomonas、Vibrio、Synechococcus、Owenweeksia等, 其中 Vibrio、Pseudomonas和 Owenweeksia等屬中包含了部分對蝦病原菌或條件性致病菌種類。

圖2 核心微生物群在屬水平上的熱圖Fig. 2 The heatmap of core microbiome in genus level注: 圖中橫向為物種注釋信息, 縱向為樣品信息, 左側(cè)的聚類樹為物種聚類樹, 上方的聚類樹為樣品組間的聚類樹, 中間熱圖對應(yīng)的值為每一行物種相對豐度經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理后得到的Z值(即一個樣品在某個分類上的Z值為樣品在該分類上的相對豐度和所有樣品在該分類的平均相對豐度的差除以所有樣品在該分類上的標(biāo)準(zhǔn)差所得到的值)。

2.2.3 雌雄蝦養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落的 α-多樣性 如表 2所示, 雌蝦池 3個樣品(C1.2、C2.2、C3.2)群落豐度指數(shù)ACE指數(shù)(471.484、495.638和444.435 )和Chao1指數(shù)(458.628、488和428.484)略高于雄蝦池3個樣品(X1.1、X2.2、X3.2)的 ACE 指數(shù)(486.375 、422.907 和 376.52 )和 Chao1 指數(shù)(447.939 、387.511和 353.13 )。雌蝦池 3個樣品(C1.2、C2.2、C3.2)的Shannon多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)也略高于雄蝦池3個樣品(X1.1、X2.2、X3.2)。比較雌雄蝦養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落的 α-多樣性指數(shù)得知, 雌蝦養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落多樣性和豐度均高于雄蝦水體。對雌雄蝦養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落α-多樣性指數(shù)進行T-test檢驗得知,Chao1、ACE和 Goods-coverage指數(shù)無顯著差異(P＞0.05); Observed-species、Shannon和 Simpson指數(shù)差異顯著(P＜0.05)。

2.2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性分析 基于 weighted unifrac和 unweighted unifrac主坐標(biāo)分析時, 前兩個主坐標(biāo)的累計方差貢獻率分別為98.42%和64.58%。其中, 在weighted unifrac主坐標(biāo)分析中, 第一主坐標(biāo)PC1和第二主坐標(biāo)PC2分別占總變異來源的91.39%和7.03%。對雌雄蝦養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落β-多樣性指數(shù)進行T-test檢驗得知, 基于weighted unifrac分析, β-多樣性無顯著差異(P＞0.05); 基于unweighted unifrac分析, β-多樣性差異顯著(P＜0.05)。從LDA值分布柱狀圖(圖 4a)可以看出, Alphaproteobacteria、Proteobacteria、Rhodopbacterales、Rhodopbacteraceae、Actinomycetales、Actinobacteria、Rickettsiales、Pelagibacteraceae等是雌雄蝦養(yǎng)殖水體中差異顯著的物種。在雄蝦養(yǎng)殖水體中, Alphaproteobacteria、Proteobacteria、Rhodopbacterales、Rhodopbacteraceae

的 LDA值均接近于 4.8; 而對于雌蝦養(yǎng)殖水體而言,Flavobacteriales、Bacteroidetes、Flavobacteriia、Pseudoruegeria等LDA值均接近于4.8。由進化分支圖(圖 4b)知, Cryomorphaceae、Flavobacteriaceae、Flavobacteriales、Flavobacteriia在進化上屬于同一個門 Bacteroidetes; Pelagibacteraceae、Rickettsiales、Rhodopbacterales、 Rhodopbacteraceae、Alphaproteobacteria、 Gammaproteobacteria、Alteromonadales在進化上屬于同一個門Proteobacteria; 而Actinomycetales在進化上屬于單獨的一個門 Actinobacteria。Actinomycetales、Cryomorphaceae、Flavobacteriaceae、Flavobacteriales、Flavobacteriia、Rickettsiales、Alteromonadales、Pelagibacteraceae、Gammaproteobacteria是雌蝦養(yǎng)殖水體中的重要微生物類群; 而 Rhodopbacterales、Rhodopbacteraceae、 Alphaproteobacteria、Proteobacteria是雄蝦養(yǎng)殖水體的重要微生物類群。

表2 雌雄蝦養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落α-多樣性指數(shù)Tab. 2 α-diversity indices of bacterial communities in aquaculture water of male and female shrimp

圖3 基于Weighted Unifrac距離(a)和Unweighted Unifrac距離(b)的主坐標(biāo)分析Fig. 3 Principal Coordinates Analysis in weighted unifrac distance (a) and unweighted unifrac distance (b)注: 橫坐標(biāo)表示第一主成分, 百分比則表示第一主成分對樣品差異的貢獻值; 縱坐標(biāo)表示第二主成分, 百分比表示第二主成分對樣品差異的貢獻值; 圖中的每個點表示一個樣品, 其中, 黑色方塊代表雌蝦水體樣品, 紅色圓圈代表雄蝦水體樣品, 同一個組的樣品使用同一種顏色表示

3 討論

高通量測序技術(shù)在宏基因組學(xué)(Metagenomics)的研究中具有重大意義, 宏基因組學(xué)又稱為微生物環(huán)境基因組學(xué)、元基因組學(xué), 是一門直接研究自然環(huán)境下微生物群落(包含了可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的細(xì)菌、真菌和病毒等基因組的總和的學(xué)科)(Shade et al,2012)。宏基因組學(xué)研究的對象不是某特定的微生物或其細(xì)胞中的總 DNA, 而是特定環(huán)境中的總 DNA,不需要對微生物進行分離培養(yǎng)和純化, 可以全面地對微生物進行分析, 對于我們認(rèn)識和利用未培養(yǎng)微生物提供了一條新的途徑。本研究提取了凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體微生物宏基因組 DNA, 采用 Illumina HiSeq2500測序平臺分析了凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體菌群多樣性。得到有效序列 31632—45190條, 可歸納為367—496個分類操作單元。基于測序數(shù)據(jù), 評估了凡納濱對蝦雌雄養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落的特征, 比較了兩個養(yǎng)殖池水體微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的差異。雌雄蝦養(yǎng)殖池水體細(xì)菌群落的α-多樣性指數(shù)中Chao1、ACE和 Goods-coverage指數(shù)無顯著差異; Observedspecies、Shannon和Simpson 指數(shù)差異顯著。β-多樣性指數(shù)中, 基于 weighted unifrac的 β-多樣性無顯著差異; 基于unweighted unifrac的β-多樣性差異顯著。雌雄蝦養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落組成有一定差異, 這可能與雌雄蝦養(yǎng)殖池的蝦數(shù)目和蝦的大小有一定關(guān)系,雄蝦數(shù)目多于雌蝦, 但雌蝦體重均高于雄蝦。

雌雄蝦養(yǎng)殖池水體的微生物物種相對豐度排列前10的分別均是變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、疣微菌門(Verrucomicrobia)、 候選菌門(TM6)、酸桿菌門(Acidobacteria)、藍細(xì)菌門(Cyanobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和(Parvarchaeota)。變形菌門和擬桿菌門為各個樣品的優(yōu)勢菌, 在雄蝦養(yǎng)殖池水體中的平均相對豐度分別為 76.15%和 21.28%; 在雌蝦養(yǎng)殖池水體中平均相對豐度分別為66.01%和29.02%。變形菌門是海洋環(huán)境和海洋沉積物中的主要類群(Whittaker, 1972)。雄蝦養(yǎng)殖池水體中 α-變形菌綱占 73.11%, β-變形菌綱占0.23%; 雌蝦養(yǎng)殖池水體中 α-變形菌綱占 58.93%, β-變形菌綱占0.46%。α-變形菌綱和β-變形菌綱對于多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)具有降解作用, 可以利用PAHs進行生長(袁軍, 2008)。擬桿菌門是海洋環(huán)境中的重要微生物類群, 是溶解性有機物的主要消費者(Cottrell et al, 2000)。在養(yǎng)殖環(huán)境中, 殘留的餌料以及養(yǎng)殖動物的糞便在水體中未被及時分解, 便在養(yǎng)殖水體中沉積下來, 造成養(yǎng)殖池底部擬桿菌門細(xì)菌含量增加(Rosselló-Mora et al,1999)。擬桿菌門中的 Flavobacteriia綱是海水中高分子有機物的主要降解者, 雌蝦養(yǎng)殖水體Flavobacteriia綱所占的比例(9.14%)大于雄蝦養(yǎng)殖水體(1.29%), 這可能是因為雌蝦養(yǎng)殖池中殘留餌料較多而導(dǎo)致的。有機物降解菌群的大量存在可加快養(yǎng)殖水體中有機物的的降解, 從而減輕水產(chǎn)動物所面臨的環(huán)境壓力。疣微菌門在雌雄蝦養(yǎng)殖水體中所占的比例分別為0.34%和0.10%。海洋環(huán)境中廣泛分布著疣微菌門細(xì)菌, 其數(shù)量約占水體細(xì)菌總量的 2%, 該門類細(xì)菌大多屬于不可培養(yǎng)的微生物, 其功能目前尚不明確(Freitas et al, 2012)。

本研究表明, 雌雄蝦養(yǎng)殖水體的核心微生物(屬水平)明顯不同(圖 2), 特別是雌蝦養(yǎng)殖水體中包含了一些致病菌或條件性致病菌, 如弧菌、Pseudomonas和 Owenweeksia, 但這些屬不是雄蝦養(yǎng)殖水體的核心屬。其中, 弧菌是海洋環(huán)境中常見細(xì)菌, 也是海水養(yǎng)殖對蝦腸道的優(yōu)勢菌群(Gatesoupe, 1999; Oxley et al,2002)。研究表明, 弧菌對于養(yǎng)殖水體中有機物的降解具有重要意義, 同時也具有硝酸鹽異化作用(趙曉偉等,2015)。但有些弧菌對水產(chǎn)動物甚至人類具有潛在致病性, 例如, 副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)等。有研究表明, 導(dǎo)致凡納濱對蝦養(yǎng)殖過程中“早期死亡綜合征”(Early mortality syndrome, EMS)的病原可能是副溶血弧菌的特異變種(楊先樂等, 2005; Tran et al, 2013)。因此, 采取有效措施控制養(yǎng)殖環(huán)境中致病弧菌的數(shù)量對于水產(chǎn)動物的健康至關(guān)重要。

4 結(jié)論

本研究利用 HiSeq測序技術(shù)對凡納濱對蝦親蝦繁殖期養(yǎng)殖水體的微生物進行分析, 揭示了其養(yǎng)殖環(huán)境中微生物的多樣性和豐度, 為凡納濱對蝦繁殖期親蝦養(yǎng)殖過程中的病害防治及新的微生物資源的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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