胸腺重建的研究進(jìn)展①

余鄒鄒 胡麗環(huán) 徐倩蘭 宋銀宏

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院,宜昌 443002)

胸腺是維持外周免疫的重要器官，為T細(xì)胞前體發(fā)育為成熟的T淋巴細(xì)胞提供了重要微環(huán)境[1]。T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中起核心作用[2]，其對(duì)病原體及腫瘤產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，對(duì)自身抗原保持耐受，可以避免自身免疫病的發(fā)生。

胸腺體積在青春期之前達(dá)到最大值，隨后開始萎縮[3]。胸腺的衰退與個(gè)體衰老或病理損傷有關(guān)，導(dǎo)致成熟的T細(xì)胞輸出量減少。修復(fù)衰退胸腺的功能對(duì)于維持T細(xì)胞免疫應(yīng)答至關(guān)重要[4]。

除了增齡性胸腺衰退，造血干細(xì)胞移植、骨髓移植和實(shí)體器官移植前的化療、放療、免疫抑制治療和抗體治療均會(huì)造成胸腺的急性損傷，導(dǎo)致T細(xì)胞再生延遲[5]。免疫重建是移植成功的重要組成部分。胸腺非依賴性T細(xì)胞擴(kuò)增與初始T細(xì)胞的產(chǎn)生缺陷及記憶T細(xì)胞的改變有關(guān)，從而導(dǎo)致T細(xì)胞的多樣性降低，降低了免疫應(yīng)答并增加了機(jī)會(huì)致病菌感染和疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[6]。

因此，研究重建增齡性胸腺衰退和移植后胸腺功能與T細(xì)胞功能恢復(fù)的方法并探討相關(guān)機(jī)制，對(duì)于預(yù)防及治療臨床衰老性疾病及移植后的感染和腫瘤發(fā)生具有重要意義。

1 細(xì)胞過繼免疫重建胸腺并促進(jìn)T細(xì)胞再生

1.1過繼胚胎干細(xì)胞來源的胸腺上皮祖細(xì)胞樣細(xì)胞 胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ESCs)是產(chǎn)生胸腺上皮細(xì)胞的可靠來源，Sun等[7]通過實(shí)驗(yàn)?zāi)M胸腺器官發(fā)育，連續(xù)調(diào)控活化素、視黃酸、BMP和Wnt信號(hào)通路，誘導(dǎo)人ESCs分化成為胸腺上皮祖細(xì)胞樣細(xì)胞(Thymic epithelial progenitor-like cells,TEPLCs)。人ESC來源的TEPLCs表達(dá)關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子FOXN1，并能在體內(nèi)進(jìn)一步發(fā)育成為胸腺上皮細(xì)胞，表達(dá)功能性胸腺標(biāo)記MHCⅡ和自身免疫調(diào)節(jié)因子(Autoimmune regulator,AIRE)。TEPLCs驅(qū)動(dòng)的胸腺上皮細(xì)胞能促進(jìn)T細(xì)胞缺乏的小鼠生成淋巴細(xì)胞，并促進(jìn)移植了人ESCs的非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(Non-obesity diabetes/severe combined immunodeficiency,NOD/SCID)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人T細(xì)胞。Lai等[8]將小鼠ESC來源的胸腺上皮祖細(xì)胞(Thymic epithelial cell progenitors,TEPs)注射到骨髓移植(Bone marrow transplantation,BMT)后的成年小鼠體內(nèi)，TEPs可發(fā)育成TECs并促進(jìn)T細(xì)胞生成，增強(qiáng)外周T細(xì)胞數(shù)量和功能。這一方法并不會(huì)誘導(dǎo)移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease,GVHD)，但是移植物抗腫瘤活性明顯增強(qiáng)。重要的是，宿主能耐受重建的免疫系統(tǒng)，包括對(duì)小鼠ESC和骨髓供體抗原的耐受。因此ESC來源的TEPs可能提供了一種快速而有效的方法，用于在BMT后改善T細(xì)胞免疫缺陷，并誘導(dǎo)對(duì)ESC來源的組織和器官移植的耐受。移植小鼠ESC來源的TEPs也可增強(qiáng)衰老小鼠同基因移植受體的胸腺細(xì)胞生成，逆轉(zhuǎn)了增齡性胸腺衰退，這為增強(qiáng)老年人免疫功能從而降低感染風(fēng)險(xiǎn)提供了思路[8]。

1.2過繼幼年增殖胸腺上皮細(xì)胞 Kim等[3]通過異時(shí)異種共生觀察到，幼年小鼠的循環(huán)因子不足以驅(qū)動(dòng)衰老胸腺的重建。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將幼年小鼠的TECs移植到衰退或有缺陷的胸腺中，其在胸腺中可定植并具有功能，促進(jìn)胸腺生長(zhǎng)并增加T細(xì)胞生成。胸腺內(nèi)移植和體外移植形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)：在小鼠出生后1 d，TECs的移植和增殖能力已經(jīng)開始減弱。與之相反的是，胸腺接受TECs移植的能力不隨年齡的增長(zhǎng)而衰退，但是TECs克隆形成細(xì)胞隨著年齡增長(zhǎng)而減少。Kim等[3]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：胸腺的生長(zhǎng)及衰退是由具有增殖能力的TECs的細(xì)胞內(nèi)在變化所驅(qū)動(dòng)，也進(jìn)一步證明，幼年的TECs可以移植并直接驅(qū)動(dòng)胸腺的生長(zhǎng)，并具有恢復(fù)T細(xì)胞再生的能力。

1.3過繼間充質(zhì)干細(xì)胞 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte growth factor,HGF)能促進(jìn)許多種類的細(xì)胞增殖。Jung等[1]證實(shí)使用干細(xì)胞依賴的HGF基因療法能增強(qiáng)急性損傷后的胸腺重建：通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染含有HGF的pMEX 表達(dá)載體，產(chǎn)生HGF過表達(dá)的人類脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(HGF-overexpressing human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,HGF-hATMSCs)。HGF-hATMSCs產(chǎn)生的HGF能增強(qiáng)小鼠胸腺上皮細(xì)胞系的增殖和體外IL-7的表達(dá)。將HGF-hATMSCs過繼給急性胸腺損傷小鼠，其胸腺的大小、質(zhì)量、胸腺細(xì)胞(尤其是早期胸腺祖細(xì)胞)和CD4-/CD8-在胸腺中的數(shù)量都有明顯的增長(zhǎng)。因此HGF-hATMSCs具有刺激胸腺細(xì)胞再生的作用。

1.4直接過繼造血祖細(xì)胞 盡管造血干細(xì)胞移植可以治療重癥聯(lián)合免疫缺陷患者，但對(duì)于存在淋巴細(xì)胞發(fā)育基因失調(diào)的個(gè)體，仍需要額外的方法提高其T細(xì)胞免疫能力。Tuckett等[9]利用影像引導(dǎo)的胸腺內(nèi)注射方法將造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞注射入非肥胖型糖尿病及IL2受體γ鏈缺失的重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD-SCID IL2rγnull,NSG)小鼠體內(nèi)，有效促進(jìn)了功能性T細(xì)胞再生并保護(hù)其免疫力。Tuckett等發(fā)現(xiàn)過繼同種異體造血細(xì)胞后的胸腺重建在幼年雄性小鼠體內(nèi)最顯著，其研究結(jié)果還表明：即使在嚴(yán)重的免疫缺陷條件下，性別和年齡仍是影響胸腺功能的重要因素；同種異體T細(xì)胞在體內(nèi)表現(xiàn)出抗淋巴瘤活性，但是沒有嚴(yán)重的自身免疫反應(yīng)和同種異體反應(yīng)，也就意味著免疫失調(diào)不是主要考慮的因素。因此在嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠胸腺內(nèi)注射造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞，是建立、保護(hù)T細(xì)胞免疫功能安全有效的方法。

2 免疫分子或轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)分子使胸腺重建并促進(jìn)T細(xì)胞再生

Zhang等[10]2014年報(bào)道，射線照射小鼠與未照射小鼠相比較，淋巴多能祖細(xì)胞和共同淋巴樣祖細(xì)胞進(jìn)入胸腺的數(shù)量減少10倍以上。射線照射后，小鼠胸腺歸巢細(xì)胞數(shù)量伴隨CCL25減少而顯著減少。Zhang等[10]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用CCL25和CCL21預(yù)處理骨髓祖細(xì)胞，能增加輻射后胸腺歸巢細(xì)胞的數(shù)量，并促進(jìn)胸腺重建。Hsieh等[11]2015年報(bào)道，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)與IL-7融合細(xì)胞因子(GIFT7)可增強(qiáng)胸腺皮質(zhì)的增生，并促進(jìn)CD44intCD25-雙陰性1(Double negative 1，DN1)胸腺祖細(xì)胞的擴(kuò)增。用GIFT7體外處理DN和SPCD8+(single positive CD8+)細(xì)胞，能阻止細(xì)胞凋亡。在正常幼年小鼠體內(nèi)，GIFT7可誘導(dǎo)短暫的胸腺增生，且能逆轉(zhuǎn)增齡性胸腺衰退并擴(kuò)增CD44intDN亞群。在衰老小鼠感染巨細(xì)胞病毒后，GIFT7介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞再生使病毒特異性CD8+細(xì)胞的數(shù)量明顯增加。Lucas等[12]隨后發(fā)現(xiàn)淋巴毒素β受體(Lymphotoxin β Receptor,LTβR)在正常條件和骨髓移植后均能控制T細(xì)胞祖細(xì)胞進(jìn)入胸腺。實(shí)驗(yàn)證實(shí)：LTβR調(diào)節(jié)黏附分子在胸腺內(nèi)的表達(dá)，而這些黏附分子在誘導(dǎo)T細(xì)胞祖細(xì)胞歸巢中起重要作用。最終，抗體介導(dǎo)的LTβR在體內(nèi)通過刺激胸腺基質(zhì)表達(dá)黏附分子，從而促進(jìn)骨髓移植后早期的胸腺恢復(fù)，并增加供體來源T細(xì)胞數(shù)量。因此，Lucas等揭示了胸腺定植中LTβR與胸腺基質(zhì)細(xì)胞之間聯(lián)系，以及作為一種新的促進(jìn)移植后T細(xì)胞重建的免疫靶點(diǎn)。Tormo等[13]最近報(bào)道，對(duì)同種異體BMT模型小鼠腹膜內(nèi)注射IL-21，發(fā)現(xiàn)IL-21可以增強(qiáng)模型小鼠的免疫重建，其主要機(jī)制是觸發(fā)骨髓Lin-Sca1+c-kit+(LSK)亞群的增殖。外周初始CD4+和CD8+T細(xì)胞完全重建與正常TCRvβ分布只在IL-21治療小鼠體內(nèi)存在，而對(duì)照組無。接受IL-21的BMT模型小鼠沒有產(chǎn)生GVHD，但保留了移植物抗腫瘤作用。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，人IL-21能明顯提高移植了臍帶血的NSG小鼠體內(nèi)CD3+T細(xì)胞的數(shù)量。因此Tormo等[13]認(rèn)為IL-21是一類新的能在BMT后重建胸腺功能的細(xì)胞因子。

轉(zhuǎn)錄因子在胸腺發(fā)育及T細(xì)胞生成中起重要作用。Bredenkamp等[14]證實(shí)，上調(diào)衰老小鼠胸腺中TEC特異性轉(zhuǎn)錄因子FOXN1基因，能使胸腺重建及T細(xì)胞再生。通過上調(diào)FOXN1基因，重建的胸腺器官在結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)譜上與幼年的胸腺極其相似。上調(diào)FOXN1能夠本質(zhì)上逆轉(zhuǎn)增齡性胸腺衰退，因此通過直接操縱單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子FOXN1就能重建衰老哺乳動(dòng)物的胸腺器官。Song等[15]克隆并表達(dá)了穿膜肽與FOXN1的重組蛋白(recombinant FOXN1,rFOXN1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：rFOXN1能從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。通過胸腺內(nèi)注射，調(diào)控rFOXN1進(jìn)入造血干細(xì)胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)后的小鼠體內(nèi)，能使TECs數(shù)量增加，且TECs的總數(shù)及淋巴細(xì)胞生成增加具有rFOXN1劑量依賴性，rFOXN1的處理能夠增加早期胸腺祖細(xì)胞及所有胸腺細(xì)胞亞群的數(shù)量。因此rFOXN1有望用于促進(jìn)接受HSCT患者T細(xì)胞再生。最近Lopes等[16]報(bào)道，在胸腺重建的早期，核因子κ B受體活化因子配體(Receptor activator for nuclear factor-κ B ligand,PANKL)在CD4+胸腺細(xì)胞及淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞(LTi)中上調(diào)，中和RANKL會(huì)逆轉(zhuǎn)輻射后TEC的恢復(fù)。在BMT手術(shù)后，RANKL治療促進(jìn)了包括胸腺上皮祖細(xì)胞在內(nèi)的胸腺上皮細(xì)胞亞群的再生、淋巴祖細(xì)胞的胸腺歸巢及新的胸腺生成。其機(jī)制在于RANKL特異地增加了淋巴毒素α(Lymphotoxin α,LTα)在LTi中的表達(dá)，而LTα對(duì)胸腺再生起關(guān)鍵作用。

3 信號(hào)通路影響胸腺重建及T細(xì)胞再生

Song等[17]通過c-Met(ft/ft)小鼠和CD4-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交產(chǎn)生T細(xì)胞特異性缺乏c-Met的條件敲除(conditional knock out,cKO)小鼠，研究c-Met信號(hào)在胸腺細(xì)胞發(fā)育和修復(fù)中的作用。實(shí)驗(yàn)表明，成年及衰老的cKO小鼠與野生型小鼠相比，雖然胸腺細(xì)胞總數(shù)和胸腺細(xì)胞亞群的數(shù)量相差不大，但是cKO小鼠更容易遭受亞劑量射線和地塞米松處理造成的損傷，即c-Met敲除小鼠在胸腺受損后，其胸腺不易重建，T細(xì)胞不易再生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，6月齡與12月齡cKO小鼠與野生型小鼠相比，胸腺細(xì)胞總數(shù)和胸腺細(xì)胞亞群數(shù)量明顯下降，并且12月齡cKO小鼠的胸腺結(jié)構(gòu)與20月齡野生型小鼠的胸腺結(jié)構(gòu)相同。由此可知，c-Met在胸腺損傷后的重建中有重要作用，T細(xì)胞敲除c-Met基因后加速了增齡性胸腺衰退。

Shen等[6]通過調(diào)控GSK-3β抑制因子6-bromoindirubin 3′-oxime (BIO)活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路，提高了初始T細(xì)胞的比例，使移植有人類造血干細(xì)胞的淋巴系統(tǒng)衰竭小鼠體內(nèi)穩(wěn)態(tài)性T細(xì)胞擴(kuò)增過程中T淋巴細(xì)胞分化延遲。在體外，BIO的處理促進(jìn)了絲裂原刺激后初始T細(xì)胞的擴(kuò)增，并促進(jìn)T細(xì)胞對(duì)同種異體刺激的增殖反應(yīng)。BIO下調(diào)了效應(yīng)細(xì)胞分化過程中活化基因的表達(dá)，同時(shí)維持初始T細(xì)胞基因的表達(dá)。因此，調(diào)控GSK-3β抑制因子提高了HSCT受者體內(nèi)的T細(xì)胞的潛能，其機(jī)制是通過擴(kuò)增具有多樣T細(xì)胞受體庫的初始T細(xì)胞亞群實(shí)現(xiàn)的。

4 利用生物工程方法重建胸腺并促進(jìn)T細(xì)胞再生

Tajima等[4]開發(fā)了一種新的水凝膠系統(tǒng)來促進(jìn)TEC聚合的形成。利用熒光活化的細(xì)胞分選技術(shù)(Fluorescence-activated cell sorting,FACS )從胸腺的單個(gè)細(xì)胞中富集TEC，并用抗上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)抗體標(biāo)記，然后和抗His的IgG一起錨定在蛋白A/G的復(fù)合物上。TEC與EAKIIH6和EAK16-Ⅱ寡肽共孵育促進(jìn)了細(xì)胞聚集。然后通過增加介質(zhì)的離子濃度啟動(dòng)凝膠化。移植入無胸腺裸鼠體內(nèi)后，TEC聚集并嵌入EAK水凝膠，能有效促進(jìn)T細(xì)胞的功能發(fā)育。

Fan等[18]構(gòu)造了去除細(xì)胞的小鼠胸腺基質(zhì)三維支架，其在培養(yǎng)基中能維持胸腺上皮細(xì)胞活性與獨(dú)特的分子功能。將構(gòu)建的胸腺類似器官移植到裸鼠體內(nèi)，能有效促進(jìn)淋巴細(xì)胞祖細(xì)胞歸巢和淋巴細(xì)胞生成。Fan等證實(shí)：通過生物工程構(gòu)建的胸腺類器官能恢復(fù)胸腺功能，并提供了胸腺重建技術(shù)在器官移植和再生醫(yī)學(xué)中的臨床價(jià)值。

5 小結(jié)與展望

胸腺是一個(gè)與其他器官表現(xiàn)不同的特殊器官。它對(duì)急性損傷極其敏感，并能迅速衰退。但胸腺有巨大的潛力恢復(fù)其功能。隨著年齡增長(zhǎng)，胸腺再生能力逐漸降低。因此重建胸腺功能并促進(jìn)T細(xì)胞再生是應(yīng)對(duì)增齡性胸腺衰退與醫(yī)源性胸腺損傷的重要手段。在以往胸腺重建的方法中，多通過細(xì)胞因子如：角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、IL-7和IL-22等促進(jìn)胸腺再生[19]。而近年來已證實(shí)能重建胸腺功能的方法中除了細(xì)胞因子，也可利用轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞過繼和生物工程等非傳統(tǒng)方法有效促進(jìn)胸腺功能重建與T細(xì)胞再生。因此通過多種途徑重建胸腺并促進(jìn)T細(xì)胞再生將為臨床建立安全、有效的重建免疫治療提供可靠的理論依據(jù)。

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