環(huán)狀核糖核酸的生物功能及其在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的研究進(jìn)展

畢蓮茹、王寶、羅南、侯秀偉、陳慶宇、廉瑞、趙洋綜述，宋春莉?qū)徯?/p>

環(huán)狀RNA（Circular RNA，circRNA）是一類特殊的非編碼內(nèi)源性RNA（Nocoding RNA，ncRNA），具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)且大量存在于真核轉(zhuǎn)錄組中的非編碼RNA。circRNA具有很強(qiáng)的組織特異性，且越來越多的研究表明circRNA在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及翻譯過程中均發(fā)揮著重要的作用[1]。早在20世紀(jì)70年代，Sanger等[2]就在植物類RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了circRNA，但由于當(dāng)時科技水平的限制，僅把其當(dāng)作基因轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生錯誤剪接形成的產(chǎn)物而未給予重視[3]。直到近幾年來隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展和高通量測序技術(shù)的不斷革新，circRNA的數(shù)量和部分功能才被學(xué)者們不斷發(fā)現(xiàn)。環(huán)狀RNA是一類閉合環(huán)狀RNA分子，由于無 5' 端帽子結(jié)構(gòu)及 3' 端 ，也無多聚A 尾，不受 RNA外切酶的降解，因此可以穩(wěn)定且廣泛地存在于生物界，具有進(jìn)化保守性[4]。環(huán)狀RNA按照來源主要分為外顯子環(huán)狀RNA（exon circRNA，ecircRNA）[5]、內(nèi)含子環(huán)狀 RNA（intron circRNA，ciRNA）[6]、外顯子內(nèi)含子環(huán)狀RNA（exon-intron circRNA，EIciRNA）[7]三類。本文主要介紹環(huán)狀RNA的生物功能及其在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中研究進(jìn)展。

1 環(huán)狀RNA的形成機(jī)制及其生物學(xué)功能

1.1 環(huán)狀RNA的形成機(jī)制

目前環(huán)狀RNA形成的機(jī)制主要有三種形式[8]：（1）內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化（intron-pairing-divern circularization），也叫直接反向剪接：主要機(jī)制是前體mRNA兩側(cè)的內(nèi)含子通過堿基互補(bǔ)配對發(fā)生環(huán)化再切除內(nèi)含子，從而形成環(huán)形RNA（circular intron RNA，ciRNA）；（2）套索驅(qū)動環(huán)化（lariat-driven circular），也被稱為外顯子跳讀（exon skipping）：主要機(jī)制是外顯子跳讀，即前體mRNA 下游外顯子的剪接供體（splice donor，SD）的3′端連接到pre-mRNA上游外顯子的剪接受體（splice acceptor，SA）的5′端形成套索結(jié)構(gòu)，然后切除內(nèi)含子形成環(huán)狀RNA[9]；（3）內(nèi)含子兩端的互補(bǔ)序列形成環(huán)形RNA：而對于內(nèi)含子來源的環(huán)形 RNA則依賴于內(nèi)含子兩端的互補(bǔ)序列形成環(huán)形RNA，ciRNA的形成要求5’端剪接位點(diǎn)富含7nt GU序列，3’端富含11nt C序列，兩者共同作用使得內(nèi)

含子首尾相連，形成ciRNAs[6]。其中前兩種已得到廣泛認(rèn)可，是ecircRNA主要形成方式，若沒有切除內(nèi)含子則形成EIciRNA[7]。

還有一種學(xué)說認(rèn)為環(huán)狀RNA通過RNA結(jié)合蛋白配對驅(qū)動的環(huán)化，即由結(jié)合在前體mRNA上內(nèi)含子兩側(cè)的互補(bǔ)序列上的RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）相互作用形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，促進(jìn)頭尾兩端的終末連接，最后形成circRNA 或 EIciRNA[10]。

1.2 環(huán)狀RNA的生物學(xué)功能

1.2.1 作為 微小RNA 分子的海綿體

近些年研究發(fā)現(xiàn)eiRNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，可以作為micro RNA的分子海綿從而發(fā)揮相應(yīng)的功能[11]。已知miRNA是由約22個內(nèi)源性非編碼的核苷酸組成，可以和與之互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，抑制其翻譯或促進(jìn)其降解，從而實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的負(fù)性調(diào)節(jié)效果[12]。例如小腦變性相關(guān)蛋白1（cerebellar degeneration-related protien 1）的環(huán)形反義轉(zhuǎn)錄物CDR1as含有大約 70 個 miRNA-7（microRNA-7，miR-7） 的結(jié)合位點(diǎn)，可以和miR-7大量結(jié)合，抑制其活性導(dǎo)致 miR-7 靶基因的表達(dá)水平增加[13]。已有實(shí)驗(yàn)表明[14]，CDRlas會損害斑馬魚的中腦功能，產(chǎn)生與miR4敲降類似的效果；而當(dāng)CDR1as 低表達(dá)時，miR-7 的靶基因表達(dá)水平也相應(yīng)降低。因此，CDR1as 又被稱為 miR-7 的分子海綿。Hansen等[15]研究發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸中存在環(huán)狀Y染色體性別決定區(qū)基因 （circular sex-determining region Y，circSRY），該基因含有16個miRNA-138結(jié)合位點(diǎn)，可以和miRNA-138結(jié)合，抑制其活性，從而調(diào)控miRNA-138的表達(dá)水平。Zheng等[16]發(fā)現(xiàn)環(huán)狀同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白凝酶3（circ-HIPK3）作為人類細(xì)胞的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)劑，可作為mi-RNA的分子海綿，直接結(jié)合并抑制活性miR-124表達(dá)，已知circ-HIPK3在膀胱癌組織和細(xì)胞系顯著下調(diào)，分別與膀胱癌分級、浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)circ-HIPK3有miR-558兩個結(jié)合位點(diǎn)，可以充當(dāng)miR-558的分子海綿[17]。由此可見環(huán)狀RNA作為miRNA的分子海綿是一種普遍現(xiàn)象。

1.2.2 與蛋白質(zhì)相互作用

環(huán)狀RNA具有蛋白吸附功能，可以作為蛋白質(zhì)海綿發(fā)揮功能。Ashwal-Fluss等[18]研究顯示環(huán)狀盲肌基因（circMBL）是由盲肌編碼基因第二個外顯子環(huán)化形成的，其側(cè)翼內(nèi)含子上有許多盲肌蛋白結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)MBL水平升高時，MBL與pre-mRNA結(jié)合，促進(jìn)MBL編碼基因環(huán)化形成circMBL，同時抑制MBL基因經(jīng)典剪接過程來降低MBL的水平；而新生成的circMBL 再吸附多余的MBL，使MBL水平降低，Ashwal一Fluss等發(fā)現(xiàn)肌強(qiáng)直營養(yǎng)不良（myotonic dystrophy，MD）可能與上述機(jī)制有關(guān)。還有CDR1as 和SRY circRNAs可與miRNA 效應(yīng)因子阿格蛋白（Argonaute， AGO） 相結(jié)合，從而被降解[14，19]。

1.2.3 參與細(xì)胞周期及細(xì)胞衰老調(diào)控

例如circ-Foxo3 可以與周期蛋白依賴性激酶2（cyclindependent kinase2，CDK2）、周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin-denpendent kinase inhibitor1，p21 ）形成復(fù)合體，p21可以阻礙CDK2與周期蛋白A、周期蛋白E結(jié)合，從而抑制細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期[9]。circ-Foxo3與抗衰老相關(guān)蛋白分化抑制因子1（inhibitor of differentiation -1，ID1）、E2F轉(zhuǎn)錄因子1（E2F1）及抗應(yīng)激蛋白粘著斑激酶（facal adhesion-associated protein kinase，F(xiàn)AK）、低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1α）結(jié)合，使ID1、E2F1、FAK、HIFa不能進(jìn)入細(xì)胞核或線粒體中發(fā)揮抗衰老作用[20，21]。

1.2.4 參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄

與外顯子來源的環(huán)狀RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中不同的是，外顯子及內(nèi)含子共同組成的環(huán)狀RNA（exon-intron circ RNA）、內(nèi)含子來源的環(huán)狀RNA（intronic circRNA）主要存在細(xì)胞核中，因此ciRNA和EIciRNA可能參與親本基因的調(diào)控[6，7]。其中EIciRNA可以與U1小核糖核蛋白（U1 snRNP）結(jié)合形成ElciRNA-U1snRNP復(fù)合物，此復(fù)合體在與親本基因啟動子上再和聚合酶Ⅱ（P01Ⅱ）結(jié)形成ElciRNAU1snRNP-PolⅡ復(fù)合體，使RNA polⅡ聚集從而提高親本基因的轉(zhuǎn)錄。例如有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞circEIF3J和circPAIP2可以分別與U1 snRNP通過RNA-RNA方式相互結(jié)合，順式調(diào)控親本基因的表達(dá)[7]；還有研究發(fā)現(xiàn)一些ciRNA（ci-ankrd52，ci-sirt7）也可以與U1小核糖核蛋白（U1 snRNP）、RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域52（ciankyrin repeat domain52，ci-ankrd52）是來源于 ankrd52的ciRNA，存在于轉(zhuǎn)錄點(diǎn)附近，可以與RNA polⅡ結(jié)合發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用，從而促進(jìn)基因的表達(dá)，提高ankrd52的轉(zhuǎn)錄效率；當(dāng)ci-ankrd52被特異性敲除之后，ankrd52的轉(zhuǎn)錄效率明顯降低[6]。

1.2.5 其他

有報(bào)道指出環(huán)狀RNA可以轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白，可能的機(jī)制是環(huán)狀RNA與核糖體結(jié)合并通過滾環(huán)復(fù)制進(jìn)行翻譯[22]；Holdt等[23]研究發(fā)現(xiàn)circANRIL可以與一種編碼核仁蛋白的基因（pescadillo homolgue 1，PES1）結(jié)合，從而抑制PES1與prerRNA結(jié)合后介導(dǎo)的核酸外切酶對pre-rRNA的加工，進(jìn)而影響核糖體的成熟。

2 環(huán)狀RNA在冠心病發(fā)生、發(fā)展過程中的生物作用

2.1 環(huán)狀RNA影響血管內(nèi)膜的粥樣斑塊形成

人類全基因組關(guān)聯(lián)分析，染色體9p21.3基因單核苷酸多態(tài)性與動脈粥樣硬化性心臟病的易感性有關(guān)。Burd等[24]發(fā)現(xiàn)染色體9p21.3的多態(tài)性能影響INK4/ARF基因的轉(zhuǎn)錄過程。已知INK4/ARF基因可編碼3種已知的抑癌基因p16INK4a、p15INK4b、p14ARF和一條長鏈反義非編碼RNA（antisense non-coding RNA in the INK4 lous，ANRIL）。 其 中 p16INK4a沉默可導(dǎo)致動脈內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增厚，p14ARF沉默可導(dǎo)致粥樣斑塊形成，p16INK4a、p15INK4b參與轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）信號通路，其沉默可導(dǎo)致粥樣斑塊形成[25]。ANRIL可以與多梳蛋白復(fù)合物（polycomb repressive complex，PRC）：PRC1、PRC2結(jié)合，使PCR1、PCR2與 p16INK4a、p14ARF和 p15INK4a基因結(jié)合使組蛋白H3甲基化引起這些基因靜默，將導(dǎo)致血管內(nèi)膜增生、粥樣斑塊形成等病理性改變。cANRIL是ANRIL轉(zhuǎn)錄過程中存在“外顯子跳讀”現(xiàn)象環(huán)化形成的。Holdt等[23]研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者體內(nèi)circANRIL/Lin ANRIL比例較高，而且circANRIL 高表達(dá)的患者很少發(fā)生冠心病?？赡苁莄ircANRIL可以與PES1結(jié)合，從而抑制PES1與prerRNA結(jié)合后介導(dǎo)的核酸外切酶對pre-rRNA的加工，進(jìn)而促進(jìn)核糖體的成熟，這將導(dǎo)致核仁應(yīng)激和p53激活，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞凋亡和增殖抑制，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。

2.2 環(huán)狀RNA與心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷

在小鼠缺血再灌煮損傷心肌梗死模型中Geng等[26]發(fā)現(xiàn)小腦變性相關(guān)蛋白1基因的反義轉(zhuǎn)錄環(huán)狀RNA—CDR1as和miR-7的表達(dá)均上調(diào)，且兩者的表達(dá)水平隨心肌梗死面積的增大而升高。該研究發(fā)現(xiàn)CDR1as過表達(dá)可以通過激活caspase-3促缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，而且CDR1as可以通過上調(diào)多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）和轉(zhuǎn)錄因子SP1的表達(dá)水平來增大心肌梗死的梗死面積，但之后通過miR-7過表達(dá)過程使其逆轉(zhuǎn)。已知PARP和SP1均是miR-7的下游蛋白，可以引起細(xì)胞凋亡，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者[26～28]。這表明，miR-7a能夠作用于其靶標(biāo)PAPP和SP1，從而保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)凋亡。此外，CDR1as在體內(nèi)的過表達(dá)可能加重MI的發(fā)展、增加心肌梗死面積，以及顯著上調(diào)PARP和SP1，而miR-7a過表達(dá)明顯減弱了CDR1as誘導(dǎo)的這些變化。

2.3 環(huán)狀RNA參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)

ZNF609基因表達(dá)產(chǎn)物是鋅指蛋白家族成員，其亞型cZNF是內(nèi)皮細(xì)胞高度表達(dá)的環(huán)狀RNA之一。Chang等[29]發(fā)現(xiàn)cZNF609可以通過cZNF609/miR-615-5p/MEF2A信號網(wǎng)參與血管內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)。已知cZNF609是miR-615-5p的分子海綿，其相互結(jié)合抑制miR-615-5p的活性，促進(jìn)肌細(xì)胞增強(qiáng)因子（myocyte enhancer factor 2A，MEF2A）的表達(dá)，MEF2A過表達(dá)能模擬cZNF609沉默介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、管腔形成并保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激或缺氧誘導(dǎo)的凋亡。已知血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和損傷在冠心病的病理形成過程發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，與健康的志愿者相比，冠心病患者血液中cZNF609的水平下調(diào)；相反，冠心病患者血液miR-615-5p表達(dá)水平明顯升高。因此，cZNF609可能通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能來參與冠心病的保護(hù)機(jī)制。

2.4 環(huán)狀RNA參與調(diào)節(jié)血管平滑肌功能

已知MiR-130a-3p 與冠狀動脈硬化成負(fù)相關(guān)[30]，其表達(dá)下調(diào)可以導(dǎo)致患有冠狀動脈疾病患者的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙[31]。TRPM3屬于瞬時受體電位（TRP）通道家族，能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)[32]。Pan等[33]在冠心病患者血漿中確定了24個差異表達(dá)的circRNAs（18個上調(diào)和6個下調(diào)）。其中包括 9 個 circRNAs， 即 hsa_circ_0089378，hsa_circ_0083357，hsa_circ_0082824，hsa_circ_0068942，hsa_circ_0057576，hsa_circ_0054537，hsa_circ_0051172，hsa_circ_0032970， 和 hsa_circ_0006323，這些circRNAs是hsa-miR-130a-3p分子海綿，可以抑制hsa-mir-130a-3p表達(dá)，使TRPM3的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而與膽固醇一起調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的增殖與收縮，進(jìn)而影響心臟血管的收縮功能?？赡軈⑴c變異性心絞痛的形成過程。

2.5 環(huán)狀RNA作為冠心病診斷的生物標(biāo)志物

環(huán)狀RNA是閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被RNA酶水解，比線性RNA穩(wěn)定[4]，廣泛存在于體液中且位于細(xì)胞內(nèi)，數(shù)量大、序列高度保守，具有組織和時間特異性，容易出膜和進(jìn)入體液，因此，具有作為疾病診斷標(biāo)志物的潛質(zhì)[34]。

Burd等[24]研究發(fā)現(xiàn)靠近INK4a/ARF基因位點(diǎn)的反義轉(zhuǎn)錄物——ANRIL與動脈粥樣硬化存在易感性，其在轉(zhuǎn)錄過程中存在“外顯子跳讀”現(xiàn)象環(huán)化形成cANRIL，RNA測序發(fā)現(xiàn)大量的環(huán)形RNA可以穩(wěn)定存在于血液中，并且相對容易檢測到，可以作為臨床潛在的疾病標(biāo)記物[34]。Zhao等[35]從12例冠心病患者和12名對照者的外周血中提取所有RNA進(jìn)行circRNA基因檢測分析和受試者工作曲線分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0124644的敏感度和特異度最高（分別是86.7%和76.7%）具有生物標(biāo)志物的診斷價(jià)值；當(dāng)引入了hsa_circ_0098964時，結(jié)果表明，hsa_circ_0124644和hsa_circ_0098964組合作為生物標(biāo)志物對冠心病診斷價(jià)值較高。hsa_circ_0124644和hsa_circ_0124644與hsa_circ_0098964相結(jié)合的診斷價(jià)值高于常規(guī)心電圖和運(yùn)動平板實(shí)驗(yàn)（Treadmill Exercise Test，TET）， 并 約 等 于 Holter監(jiān) 測。Zou等[36]用DNA試劑盒從342例男性冠心病患者外周血單核細(xì)胞中提取出has-cirrc-0041103，研究發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，冠心病患者外周血has-cirrc-0041103明顯升高，其敏感度和特異度分別是0.595和0.612，這表明has-cirrc-0041103有望成為冠心病的生物標(biāo)記物。

3 展望

近年來，環(huán)狀RNA的研究已經(jīng)成為一個新的熱點(diǎn)，隨著研究的不斷深入，環(huán)狀RNA的形成機(jī)制、生物功能及在冠心病中的作用已嶄露頭角，這為冠心病的診療提供了一個新的思路，使冠心病的研究向精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方向發(fā)展，這將更好的造福于人類。然而，由于目前的對環(huán)狀RNA的研究還處于初期階段，對于環(huán)狀RNA是如何在冠心病中發(fā)揮作用的、是否會影響冠心病的預(yù)后以及是否可以作為冠心病的診斷標(biāo)記物而在臨床上得到廣泛應(yīng)用等，仍是我們未來需要不斷探究的問題。