多重PCR技術(shù)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原檢測(cè)中的應(yīng)用

張飛燕，趙 玲，金 潔，王 蕓，呂龍寶,2*

(1.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，昆明 650000； 2.中國(guó)科學(xué)院昆明靈長(zhǎng)類研究中心，昆明 650223)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)和條件，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量直接影響眾多領(lǐng)域科學(xué)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，也關(guān)系到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從業(yè)人員和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作者的健康[1]。因此，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量控制成為制約性要素，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微生物、寄生蟲質(zhì)量控制顯得尤為重要。目前，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)國(guó)標(biāo)GB 14922.2-2011，針對(duì)細(xì)菌檢測(cè)推薦的方法是病原菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定，但耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，易受檢測(cè)人員的主觀判定干擾；針對(duì)病毒檢測(cè)主要采取血清學(xué)方法檢測(cè)，但對(duì)于一些動(dòng)物病毒呈周期性病毒，在排毒的時(shí)候，體內(nèi)無抗體，通過血清學(xué)方法檢測(cè)，就易造成假陰性。針對(duì)寄生蟲檢測(cè)主要采用直接涂片法或飽和氯化鈉漂浮法，也受檢測(cè)人員的判定干擾。此外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多采用群體飼養(yǎng)，易被各種易感病原所感染，從而導(dǎo)致疾病的爆發(fā)和流行，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益，并使公共衛(wèi)生遭到威脅[2]。因此，建立一種快速、敏感、易于標(biāo)準(zhǔn)化操作的檢測(cè)技術(shù)尤為重要。多重PCR是近年來興起的一種新型檢測(cè)手段，實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)體系對(duì)多種病原微生物的檢測(cè)，或?qū)z傳病、癌基因、耐藥基因的分型鑒定，具有高效、快速、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多種病原微生物或具體哪一型病原體感染的鑒別診斷，以及為一些人獸共患病原如猴B病毒的監(jiān)測(cè)提供強(qiáng)有力的保障，在臨床上具有很高的應(yīng)用價(jià)值[3]。筆者將多重PCR技術(shù)應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疫病病原體的檢測(cè)綜述如下，并提出多重PCR未來應(yīng)用前景的展望。

1 多重PCR的原理及技術(shù)特點(diǎn)

多重PCR反應(yīng)原理與普通PCR反應(yīng)原理與試劑基本相同，通過模板DNA與引物之間的變性、退火和延伸三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)產(chǎn)生的DNA片段為下次循環(huán)的模板。多重PCR反應(yīng)就是在一個(gè)PCR反應(yīng)體系里，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)核酸片段或同一核酸片段的不同區(qū)域。目前，有很多文獻(xiàn)對(duì)影響PCR反應(yīng)的質(zhì)量條件進(jìn)行了討論，然而對(duì)影響多重PCR實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素鮮有報(bào)道。多重PCR與單重PCR最大的不同就是多對(duì)引物，因此各引物之間的濃度搭配影響最大，其次是由于擴(kuò)增多個(gè)目的DNA，因此在Mg2+、dNTP的用量上面都需要做一些調(diào)整。大量實(shí)驗(yàn)研究報(bào)告也指出，影響多重PCR成功的主要因素是：多重PCR體系里不同基因的引物對(duì)濃度、退火溫度、底物濃度應(yīng)達(dá)到平衡。在最初進(jìn)行多重PCR反應(yīng)時(shí)，需要先優(yōu)化單重PCR的引物濃度、底物濃度、退火溫度這三大重要因素，再對(duì)多重PCR體系里各引物對(duì)濃度比例、底物濃度、退火溫度探討。首先，多重PCR引物的設(shè)計(jì)必須滿足每對(duì)單引物的設(shè)計(jì)原則，根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)的各引物對(duì)應(yīng)具有高度的特異性，引物長(zhǎng)度為20 bp左右，引物的GC含量應(yīng)不小于35%，大于60%[4]；其次，多重PCR反應(yīng)體系里，各引物對(duì)的濃度很重要[5]。大部分文獻(xiàn)研究報(bào)道，在最初的多重PCR反應(yīng)體系里，需要不斷的優(yōu)化多重PCR各引物對(duì)濃度，各引物對(duì)的濃度搭配會(huì)影響某些基因的擴(kuò)增量[6-7]。解決這一問題，需要改變反應(yīng)中各種引物的比例，增加“弱”基因的引物量，減少“強(qiáng)”基因的引物量[8]。退火溫度也是影響多重PCR反應(yīng)的一個(gè)重要參數(shù)，大部分學(xué)者經(jīng)驗(yàn)表明多重PCR里的退火溫度要比單獨(dú)擴(kuò)增時(shí)的退火溫度低4℃左右，退火溫度55℃左右，效果最優(yōu)[9]，并建議所有引物對(duì)的最適退火溫度要盡可能的相同，這樣有助于多重PCR選擇的退火溫度保證每對(duì)引物都有相同的擴(kuò)增率[10]。也有學(xué)者提出，高的退火溫度使基因的擴(kuò)增量減少，盡管可用延長(zhǎng)退火和延伸時(shí)間來解決這一問題。也有文獻(xiàn)報(bào)道指出，多重PCR實(shí)驗(yàn)中，通過增長(zhǎng)延伸時(shí)間能提高PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。Henegariu等[11]研究報(bào)道，在一個(gè)X、Y染色體引物同時(shí)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，通過增加延伸時(shí)間，發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量也增加了，同時(shí)試圖增加一個(gè)反應(yīng)體系擴(kuò)增4個(gè)Y 染色體上的基因的延伸時(shí)間，也發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量增加。對(duì)于dNTP濃度，大量實(shí)驗(yàn)研究證明，使用dNTP 濃度較低(最低50 μmol/L)，不抑制擴(kuò)增，但會(huì)使擴(kuò)增產(chǎn)物量減少；dNTP 濃度大于400 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增被迅速抑制[12-14]。另外，也有研究報(bào)道緩沖液中dNTP、MgCl2、KCl濃度的平衡，也影響著擴(kuò)增的效率[15]。有研究指出，Mg2+能提高Taq DNA 聚合酶的活性，能提高擴(kuò)增效率；同時(shí)指出長(zhǎng)片段的擴(kuò)增引物在低鹽濃度下擴(kuò)增效率更高好，短片段的擴(kuò)增引物在高鹽濃度下擴(kuò)增效率更好[16]。此外，dNTP母液避免反復(fù)凍融。最后，對(duì)于反應(yīng)體系中佐劑的使用，大部分學(xué)者認(rèn)為在反應(yīng)體系里加DMSO和甘油(參考范圍為：5%～10% (V/V))，可提高產(chǎn)物量和特異性[17]。一部分學(xué)者認(rèn)為，加入0.8 μg/ μL BSA能更好的提高PCR擴(kuò)增效率[18]。然而，也有反對(duì)的聲音，在反應(yīng)體系里加DMSO 會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。至于選擇什么樣的佐劑提高多重PCR擴(kuò)增效率，有待更深入的研究。

多重PCR具有高效性，在同一PCR反應(yīng)體系能同時(shí)檢出多種病原微生物，或進(jìn)行基因分型，只需要?jiǎng)游锏囊坏窝?，一根毛發(fā)或組織分泌物就可檢測(cè)多種病原體。此外，多重PCR具有系統(tǒng)性，多重PCR適用于病毒、腸道細(xì)菌等多種混合病原體的檢測(cè)，理論上只要條件允許，引物對(duì)的數(shù)量可以不限，目前有擴(kuò)增9條目的片段的記錄[19]。但該技術(shù)需要對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行多次優(yōu)化。另外，多重PCR技術(shù)能在同一反應(yīng)體系快速鑒別診斷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多種病原體的混合感染，具有方便、快速、經(jīng)濟(jì)適用的優(yōu)點(diǎn)，能及時(shí)為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。

2 多重PCR在細(xì)菌、真菌混合感染檢測(cè)中的應(yīng)用

目前我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物等級(jí)及監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)GB 14922.2-2011，針對(duì)豚鼠、地鼠、兔、犬和猴；清潔級(jí)以上小鼠、大鼠病原菌檢測(cè)主要采用傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)、鏡檢、生化鑒定，此種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，多重PCR技術(shù)可以同時(shí)對(duì)這幾種病原菌進(jìn)行檢測(cè)，具有高靈敏度、高效、低成本等優(yōu)點(diǎn)。

祝巖波等[20]建立了金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌多重PCR檢測(cè)方法，對(duì)76份感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明建立的多重PCR方法對(duì)每種病原菌DNA最低檢測(cè)質(zhì)量能達(dá)到10 pg。王鵬飛等[21]建立了金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體多重PCR檢測(cè)方法，該方法對(duì)三種菌的檢測(cè)靈敏度達(dá)到1～10 pg。陸紅玉等[22]建立了適合食蟹猴志賀氏菌、沙門氏菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌這三種致病菌快速檢測(cè)的多重PCR方法，該方法對(duì)137例食蟹猴肛拭子中志賀氏菌屬、沙門氏菌屬和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌3 種病原菌檢測(cè)的靈敏度達(dá)到100～200 CFU/mL。上述三種多重PCR方法都與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法和單重PCR方法比較，證實(shí)該方法能從混合感染的標(biāo)本中，檢測(cè)出不同的病原菌，檢測(cè)結(jié)果的一致性為96%～100%，且細(xì)菌檢出率高于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法，說明該方法具有很高的檢測(cè)靈敏度和特異性，具有很強(qiáng)的實(shí)用性和潛在的發(fā)展力。

邢進(jìn)[23]等建立了石膏樣毛癬菌(Tm)、石膏樣小孢子菌(Mg)、犬小孢子菌(Mc)和猴類毛癬菌(Am)的多重PCR檢測(cè)方法，對(duì)260份實(shí)驗(yàn)動(dòng)物毛發(fā)樣本進(jìn)行檢測(cè)，最低檢測(cè)限達(dá)到5.9 ～9.5 pg/μL，且檢測(cè)結(jié)果均為陰性，未發(fā)現(xiàn)4種真菌的感染，與SDA方法檢測(cè)結(jié)果一致，證明在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的皮膚真菌感染率始終保持在極低水平；對(duì)15份人工感染四種不同真菌的大鼠毛發(fā)檢測(cè)，準(zhǔn)確的檢測(cè)出不同的菌株組合。證明該法具有良好的可重復(fù)性、靈敏性、特異性，可用于在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚病原真菌的快速檢測(cè)和篩查，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

3 多重PCR在病毒性混合感染的病原檢測(cè)中的應(yīng)用

目前實(shí)驗(yàn)室病毒檢測(cè)方法主要參照國(guó)標(biāo)GB 14922.2-2011，采用ELISA血清學(xué)的方法檢測(cè)，但這種方法的敏感性和特異性取決于抗原的制備[24]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，病毒大量增殖時(shí)動(dòng)物尚未產(chǎn)生抗體，隨著抗體的產(chǎn)生，病毒逐漸清除[25-26]。通常感染猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV)和猴T細(xì)胞趨向病毒1型(STLV-1)的獼猴通常不表現(xiàn)出臨床癥狀，體內(nèi)可能會(huì)產(chǎn)生較低水平的抗體，或在感染后很長(zhǎng)一段時(shí)間，體內(nèi)仍無血清學(xué)轉(zhuǎn)化。因此檢測(cè)這兩種病毒不應(yīng)采用血清學(xué)方法。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，通常對(duì)所有血清學(xué)陰性的動(dòng)物再次結(jié)合PCR進(jìn)行檢測(cè)。李曉燕等[27]建立了一種能同時(shí)檢測(cè)獼猴STLV-1和SRV/D-1兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒的多重PCR方法，結(jié)果顯示建立的多重PCR方法能同時(shí)檢測(cè)出獼猴體內(nèi)可能存在的STLV-1和SRV/D-1 兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒，可用于獼猴種群逆轉(zhuǎn)錄病毒的定性監(jiān)測(cè)。

大量文獻(xiàn)對(duì)其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如大小鼠[28]、水貂[29]、犬[30]、樹鼩[31]、兔[32]等應(yīng)用建立的多重PCR方法檢測(cè)病毒混合感染，結(jié)果表明所建立的多重PCR方法具有快速高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量監(jiān)測(cè)。饒丹等[33]建立了鑒別檢測(cè)大鼠細(xì)小病毒(RPV)與其他三種大鼠細(xì)小病毒(H-1、KRV、RMV)的多重PCR方法，多重PCR結(jié)合測(cè)序在檢測(cè)23份臨床樣本中，PCR的最低檢測(cè)限可達(dá)1000拷貝每微升，檢測(cè)出30.43%的RMV陽(yáng)性，具有靈敏度高及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是一種簡(jiǎn)便、可靠的檢測(cè)方法。以及近來廣東實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所設(shè)利用多重PCR技術(shù)和Luminex技術(shù)結(jié)合，建立了一種可以同時(shí)檢測(cè)大鼠5種病原體的方法；應(yīng)用多重PCR熒光技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠腦脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的檢測(cè)等，證實(shí)這兩種方法都具有快速高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。綜上所述，表明多重PCR技術(shù)應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒檢測(cè)有很大的優(yōu)勢(shì)和發(fā)展?jié)摿?，利用多重PCR技術(shù)與其它新型技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的檢測(cè)，將是未來研究的一個(gè)方向。

4 多重PCR技術(shù)在細(xì)菌耐藥性方面的研究

動(dòng)物濫用藥導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性已成為全世界關(guān)注的熱點(diǎn)問題，且我國(guó)動(dòng)物源細(xì)菌性監(jiān)測(cè)工作起步比較晚，動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性檢測(cè)能力仍嚴(yán)重不足[34]。大腸桿菌、沙門氏菌等是動(dòng)物易感染的細(xì)菌，雖然可通過改善養(yǎng)殖條件和加強(qiáng)飼養(yǎng)管理來防治，但目前仍主要通過抗菌劑治療[35]。特別是針對(duì)實(shí)驗(yàn)猴這類高等動(dòng)物，沙門菌病和由志賀菌屬引起的細(xì)菌性痢疾是實(shí)驗(yàn)猴常見的腸道病[36]。這兩種病治療均以抗菌為主，常選用氨芐西林、慶大霉素、氧氟沙星等來治療，抗生素雖在短期內(nèi)可緩解腹瀉癥狀，但從整個(gè)慢性病程看，并無效[37]。目前，一些動(dòng)物機(jī)構(gòu)的養(yǎng)殖人員對(duì)抗生素的使用存在錯(cuò)誤認(rèn)識(shí)，認(rèn)為多使用幾種抗生素總會(huì)有一種起作用，因此造成療效不確切時(shí)易產(chǎn)生交叉感染，使致病菌和條件致病菌耐藥性增強(qiáng)，而在有療效時(shí)也無法弄清是哪一種藥物起的作用[38]。并且還存在一些獸醫(yī)在動(dòng)物輕微感染的情況下就使用抗生素，隨著時(shí)間的累積，一旦產(chǎn)生耐藥，將導(dǎo)致患病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物治療效果不理想。目前細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測(cè)手法主要為藥敏監(jiān)測(cè)方法。藥敏試驗(yàn)由于方便、簡(jiǎn)捷、易判定的優(yōu)點(diǎn)，尤其是藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法，常用于臨床上指導(dǎo)用藥。但藥敏試驗(yàn)是在體外用藥物試探性的檢驗(yàn)細(xì)菌的表型耐藥特性，不能檢測(cè)細(xì)菌的隱型耐藥性，且藥敏實(shí)驗(yàn)受不同藥敏試驗(yàn)方法和判斷藥物敏感濃度差異等影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，目前還存在一些動(dòng)物機(jī)構(gòu)，動(dòng)物患病直接先上抗生素，再采樣進(jìn)行培養(yǎng)及鑒定和藥敏檢測(cè)，根據(jù)這個(gè)流程，真正的致病菌往往已經(jīng)受抗生素影響，等藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果出來，往往出現(xiàn)藥敏結(jié)果與臨床療效不符合的情況。而多重PCR具有的快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)，可以在同一反應(yīng)體系檢測(cè)多種極微量的耐藥基因，能更準(zhǔn)確有效的提供細(xì)菌耐藥的信息，且不需要經(jīng)過費(fèi)時(shí)的細(xì)菌培養(yǎng)，已廣泛的應(yīng)用于細(xì)菌耐藥性的研究。楊鑫等[39]利用多重PCR方法篩選了豬源雞源大腸桿菌氯霉素類藥物耐藥基因(cat1、cmlA、flor)，建立了這3種耐藥基因篩選的三重試劑盒，并利用試劑盒對(duì)33株細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)將多重PCR檢測(cè)結(jié)果和藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較，表明兩者檢出的符合率為91%；共收集來自不同省豬、雞養(yǎng)殖場(chǎng)的417株細(xì)菌，進(jìn)行豬源雞源大腸桿菌氯霉素抗性基因檢測(cè)，三種基因的檢出率分別為：41.5%、35.7%和37.2%，不同省的耐藥基因檢出率差異較明顯。目前，我國(guó)尚未有對(duì)猴場(chǎng)耐藥基因的分布及篩選的相關(guān)報(bào)道，大部分都是針對(duì)豬、雞養(yǎng)殖場(chǎng)的耐藥基因分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)調(diào)查和篩選。因此，開發(fā)和建立一種能快速篩選病原微生物耐藥基因的方法，特別是針對(duì)實(shí)驗(yàn)猴這類國(guó)家級(jí)保護(hù)動(dòng)物，用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耐藥性的研究，提高動(dòng)物感染病原菌的治療率非常有必要。因此，多重PCR技術(shù)對(duì)推進(jìn)病原物的耐藥性研究將具有十分重要的意義。

5 多重PCR技術(shù)的應(yīng)用情景

多重PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微生物、寄生蟲、細(xì)菌耐藥性等方面的檢測(cè)比單一的普通PCR技術(shù)具有方便、快捷的優(yōu)點(diǎn)，一次可以同時(shí)檢測(cè)多種基因，即達(dá)到了保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量，又節(jié)省了人力與物力。但多重PCR技術(shù)應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原檢測(cè)中也存在不足。比如假陽(yáng)性結(jié)果，研究人員可以通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格的分區(qū)，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的管理，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)立嚴(yán)格的陰陽(yáng)性對(duì)照等來消除。

多重PCR技術(shù)未來的研究主要集中在以下幾個(gè)方面。首先，多重PCR試劑盒在開發(fā)并應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的疫病檢測(cè)中，當(dāng)前主要用于豬、牛羊、大小鼠的病原微生物診斷，而應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)猴，樹鼩的檢測(cè)甚少。非人靈長(zhǎng)類是人類的近親，在生物學(xué)、遺傳學(xué)和行為學(xué)等方面與人類高度相同，被廣泛的應(yīng)用于多種疾病動(dòng)物模型的研究[40-41]，是極其珍貴的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。樹鼩，由于其體型小，孕期短，生長(zhǎng)快、容易飼養(yǎng)、在生物進(jìn)化史上更接近人類等優(yōu)點(diǎn)，作為一種新型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源，正受到廣泛的重視[42-43]。對(duì)實(shí)驗(yàn)猴、樹鼩等其它一些新型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攜帶的病毒、細(xì)菌、寄生蟲指標(biāo)進(jìn)行控制，開發(fā)和建立快速、可靠的新型監(jiān)測(cè)手段非常迫切。因此，研制針對(duì)于猴、樹鼩等新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疫病的多重PCR標(biāo)準(zhǔn)診斷試劑盒，用于動(dòng)物疫病的監(jiān)測(cè)，將有很大的應(yīng)用前景。其二，多重PCR試劑盒具有的高效快捷、高度特異敏感等優(yōu)點(diǎn)，在面對(duì)人獸共患病，公共衛(wèi)生危機(jī)方面避免了耗時(shí)、大量的費(fèi)力排查[44-45]。多重PCR試劑盒研發(fā)和生產(chǎn)，使其在公共衛(wèi)生安全診斷中發(fā)揮更大的優(yōu)勢(shì)，也是未來的一個(gè)發(fā)展方向。最后，多重PCR技術(shù)最大的價(jià)值在于它能提高診斷的敏感性。目前，后基因組時(shí)代，對(duì)基因組候選區(qū)段的重測(cè)序需求日益增加，人們對(duì)序列的關(guān)注超過了少數(shù)的SNP，候選區(qū)段的范圍可能在5～100 Kb之間，使用傳統(tǒng)sanger法或目標(biāo)區(qū)域雜交捕獲測(cè)序價(jià)格昂貴，使用多重PCR目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序很好的解決了這一難題。通過多重PCR對(duì)擴(kuò)增整個(gè)基因區(qū)域，一次性捕獲，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，多樣本同時(shí)測(cè)序，在大樣本量篩查的同時(shí)極大的降低成本。另外，多重PCR技術(shù)與其它技術(shù)的整合應(yīng)用，如多重PCR技術(shù)與LAMP、基因芯片等實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)合，進(jìn)一步提高動(dòng)物病原檢測(cè)的靈敏性、可重復(fù)性，實(shí)現(xiàn)大批量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原檢測(cè)、混合感染樣品基質(zhì)中的多種微生物的有效檢測(cè)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化，必將在未來實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原檢測(cè)中有很好的應(yīng)用前景。