尋常型天皰瘡自身抗體檢測及治療方法的進展

潘萌 鄭捷

200025上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科

尋常型天皰瘡（pemphigus vulgaris，PV）是一累及皮膚與黏膜的自身免疫性皮膚病，屬于表皮內(nèi)大皰病，臨床上較常見，可表現(xiàn)為廣泛的紅斑、松弛的水皰及糜爛、結(jié)痂面，尼氏征陽性。患者血清中存在針對橋粒黏蛋白1（desmoglein1，Dsg1，相對分子質(zhì)量160 000）和（或）抗橋粒黏蛋白3（desmoglein3，Dsg3，相對分子質(zhì)量130 000）的IgG型抗體［1］，該抗體和自身抗原結(jié)合，導(dǎo)致細胞間連接破壞，棘層松解發(fā)生和表皮內(nèi)水皰形成［2］。根據(jù)PV患者血清中存在的自身抗體類型，可以分為黏膜主導(dǎo)型（mucosal dominant）與皮膚黏膜型（mucocutaneous）。自身抗體的種類和Dsg1/Dsg3抗原在正常組織不同分布，決定了水皰在表皮內(nèi)的位置。大多數(shù)患者自身抗體的滴度和疾病嚴(yán)重度呈相關(guān)性，但部分患者例外，在這部分患者中，IgG1和IgG4抗體亞型［3］則非常重要。近年來，PV的發(fā)病機制不斷完善，除了循環(huán)自身抗體的致病作用外，我們團隊首次發(fā)現(xiàn)患者皮損局部存在抗原特異性B淋巴細胞，可產(chǎn)生特異性抗Dsg的抗體，加重局部免疫反應(yīng)，參與皮損的發(fā)生和發(fā)展。另外，在皮損局部還可檢測到漿細胞、反應(yīng)性T細胞、高內(nèi)皮小靜脈（high endothelial venule，HEV）等，從而進一步推測在PV皮損局部存在有異位淋巴結(jié)構(gòu)（ectopic lymphoid-like structure，ELS）［4］，為局部B細胞的成熟、活化、產(chǎn)生抗體提供一個必要的場所。

一、PV自身抗體的檢測手段

PV的診斷通?；诨颊叩呐R床表現(xiàn)、組織病理學(xué)及免疫病理學(xué)檢查，其中針對特異性自身抗體的檢測尤其重要，包括直接免疫熒光法（DIF）、間接免疫熒光法（IIF）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和免疫印跡技術(shù)（immunoblotting test，IBT）［5］等。

1.DIF和IIF：自身抗體的DIF檢測對于PV血清學(xué)診斷起到舉足輕重的作用，通過該方法將患者血清與正常皮膚制作成的冰凍切片進行孵育，然后再將抗人IgG的熒光抗體與已結(jié)合了血清中自身抗體的組織孵育，采用顯微鏡觀察，可以發(fā)現(xiàn)患者的IgG抗體在角質(zhì)形成細胞間沉積。目前大多DIF檢測需要人工操作及結(jié)果判斷，考慮到人為因素可能導(dǎo)致檢測結(jié)果的不確定性，有學(xué)者采用EUROTide?孵育技術(shù)結(jié)合基于生物芯片的EUROPath系統(tǒng)提出了一種新型的自動化DIF技術(shù)［6］，該系統(tǒng)使得液體可以沿固相結(jié)合組織切片連續(xù)運動通過抑制濃度梯度的形成，提高反應(yīng)速度，得到快速而均勻的染色結(jié)果，簡化了染色程序并改善了組化結(jié)果的表現(xiàn)，使其具備更高的敏感性和特異性，從而提高診斷的準(zhǔn)確性。

IIF也是一種對PV循環(huán)自身抗體進行檢測的常用工具，底物通常選擇對檢測最敏感的豚鼠或猴食道［5］。隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，更加便捷和高效的熒光檢測還在不斷涌現(xiàn)。2014年，Russo等［7］提出了一種新型的基于重組抗原底物和轉(zhuǎn)染細胞的免疫熒光檢測-生物芯片馬賽克技術(shù)（biochip immunofluorescence microscopy），可以一步法檢測抗Dsg1、抗Dsg3抗體及抗BP180、抗BP230抗體（大皰性類天皰瘡的自身抗體），該方法簡便易行，操作時間短，敏感度和特異度高，是一種可以替代經(jīng)典IIF檢測的標(biāo)準(zhǔn)化檢測手段；該技術(shù)一般采用表達重組人Dsg1、Dsg3的人類細胞（HEK293細胞）作為底物來進行患者血清中特異性抗體的體外檢測，如果需要，生物芯片馬賽克技術(shù)也可采用定制底物，特別是人鹽裂皮膚和猴食道或重組斑點；該技術(shù)的另一個優(yōu)點是可以進行底物的大批量自動生成，從而保證了檢測的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

在進行IIF檢測時，一定要注意避免ABO血型系統(tǒng)的干擾。我們曾報道臨床和組織病理表現(xiàn)為表皮下水皰的患者IIF顯示棘細胞間IgG沉積，該患者臨床上表現(xiàn)為瘙癢性紅斑基礎(chǔ)上產(chǎn)生緊張性水皰和大皰，病理表現(xiàn)為表皮下水皰形成，鹽裂DIF表現(xiàn)為真皮側(cè)IgG及C3沿基底膜帶的線狀沉積，擬診獲得性大皰表皮松解癥；但該患者卻在IIF上表現(xiàn)為天皰瘡模式，即出現(xiàn)了IIF的假陽性［8］；后查閱文獻發(fā)現(xiàn)IIF的底物，如猴食道上皮可以表達人類ABO抗原［9］，而該患者為A型血，其血清中抗B抗體結(jié)合猴食道上皮細胞表面的B抗原，從而發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，產(chǎn)生IIF的假陽性，而在我們?nèi)コ薃B型紅細胞之后，再進行IIF檢測，其結(jié)果則為陰性，所以此IIF假陽性系A(chǔ)BO血型抗體干擾所致。除此之外，燒傷、接觸性皮炎、感染及藥物反應(yīng)等患者的血清中也會出現(xiàn)自身抗體，這些患者的IIF可出現(xiàn)類似于PV患者的IIF模式，這可能是由于病理狀態(tài)下抗原模擬或抗原擴展而導(dǎo)致［10］。所以，IIF雖然是PV患者自身抗體檢測的常規(guī)方法，但它的敏感度較低，可能會出現(xiàn)檢測結(jié)果的假陽性或假陰性，因此，提高自身抗體檢測的準(zhǔn)確性還需采用多種檢測方法進行。

2.免疫印跡技術(shù)：采用表皮提取物及人類羊膜（amniotic membrane）［11］作為底物對PV患者血清中的自身抗體進行免疫印跡檢測，因系無創(chuàng)檢查，方法簡便，敏感性高，且可以檢測到較大范圍的抗體譜，甚至發(fā)現(xiàn)新的抗原，曾用于PV的診斷［12］，但由于Dsg1與Dsg3的表位多為構(gòu)象型表位，免疫印跡技術(shù)對于PV的診斷意義不大［13］，但該方法卻是發(fā)現(xiàn)和探索新的大皰性皮膚病自身抗原成分的有效手段。我們近來對4例多次檢測Dsg抗體結(jié)果均為陰性的表皮內(nèi)水皰患者進行免疫印跡檢測，切取蛋白條帶進行LC-MSMS質(zhì)譜鑒定，搜庫檢索結(jié)果提示患者自身抗體所結(jié)合的蛋白結(jié)構(gòu)與橋斑蛋白高度匹配，從而證明了該4例患者的自身抗原為橋斑蛋白，患者體內(nèi)產(chǎn)生了針對橋斑蛋白的抗體。

3.酶聯(lián)免疫吸附法：日本MBL公司及德國歐蒙公司分別采用昆蟲細胞和人類HEK293細胞表達重組人Dsg1與Dsg3的胞外段，建立了酶聯(lián)免疫吸附法，對PV患者血清中的特異性自身抗體進行定量檢測，該方法因具備敏感度及特異度高的特點，目前已越來越廣泛地用于PV的臨床診斷，并進一步對天皰瘡的臨床亞型進行分類；除此之外，多項研究表明，ELISA的反應(yīng)性與天皰瘡患者的疾病嚴(yán)重程度相關(guān)［14-16］，因此還可以用于療效評估和預(yù)后判斷，指導(dǎo)臨床治療。近幾年，日本MBL公司推出了一個新型抗體檢測試劑盒——MESACUP anti-Skin profile TEST”（ASPT），該試劑盒的微孔中分別包被了5種不同的重組抗原，可以快速同時對患者血清中抗Dsg1，抗Dsg3，抗BP180，抗BP230及抗Ⅷ型膠原的IgG抗體進行定量檢測，具有特異性高的特點，對診斷困難的大皰性皮膚病具有重要的診斷意義，還可以發(fā)現(xiàn)一些互相伴發(fā)的大皰性疾病；化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法（chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA）［17］是一種基于酶-抗體結(jié)合，采用化學(xué)發(fā)光底物和照度計進行檢測的免疫分析新方法，該方法將磁珠結(jié)合抗原顆粒作為底物，用于檢測抗原特異性Dsg抗體；CLEIA與ELISA法相比具有更多的優(yōu)勢，除了檢測更加敏感之外，該方法采用了完全自動化的系統(tǒng)，較ELISA法更為快速，而且其具備更廣的線性檢測區(qū)間，因此不需要對血清樣本進行高倍稀釋，很大程度上節(jié)約了樣本。

總之，PV自身抗體的檢測手段日趨完善，具有更高效、便捷、快速的特點，將會在臨床上進一步推廣。

二、PV治療手段

PV治療比較棘手，可能原因有幾個方面：①疾病的一線治療藥物糖皮質(zhì)激素（激素）和免疫抑制劑在使用過程中可能產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥或不良反應(yīng)；②即使疾病嚴(yán)重度評分完全相同的兩個患者，其對標(biāo)準(zhǔn)治療的反應(yīng)可能不同；③PV容易復(fù)發(fā)，而復(fù)發(fā)的患者對再次治療的敏感性降低；④天皰瘡抗體滴度的檢測沒有完全普及，缺乏科學(xué)的指導(dǎo)用藥；⑤CD20單抗——利妥昔單抗（rituximab）治療天皰瘡有效，但由于其價格昂貴和潛在的不良反應(yīng)，尚未普及應(yīng)用。因此，上述原因加大了治療難度。

目前，我們在PV的治療方面總結(jié)了十六字原則：“早期診斷、及時治療、精心護理、長期隨訪”?？偛呗允牵和扑]系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用激素和免疫抑制劑；同時局部外用激素，并根據(jù)需要外用抗菌藥物；輕度PV或皮疹局限可單獨外用激素或鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑。在上述原則上，須遵從個體化治療。PV治療上一般可分為初始治療和維持治療［18］。

1.初始治療：初始治療目標(biāo)是控制疾病活動?？刂萍膊』顒樱╟ontrol of disease activity）定義為：無新發(fā)水皰、糜爛面，現(xiàn)有皮損開始愈合［19］。

（1）激素：推薦系統(tǒng)用激素起始劑量0.5～1.0 mg·kg-1·d-1，根據(jù)疾病嚴(yán)重程度、患者年齡、及是否有基礎(chǔ)疾病進行選擇［20］。如果1～2周內(nèi)，初次用藥劑量無法控制病情，推薦藥量增加50%。有一項22例的小型隨機試驗對低劑量和高劑量激素進行了直接比較，該試驗對新診斷為PV19例或落葉型天皰瘡（pemphigus foliaceus，PF）3例患者采用高劑量潑尼松（120～150 mg/d）與較低劑量潑尼松（45～60 mg/d）治療進行了對照。高劑量組與較低劑量組實現(xiàn)初始疾病控制所需時間之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；兩組實現(xiàn)初始疾病控制的平均時間分別為20 d（5～42 d）與24 d（7～42 d）。不良反應(yīng)發(fā)生率之間的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義［21］。

（2）非甾體免疫抑制劑：推薦聯(lián)合使用激素和非甾體免疫抑制劑。臨床研究已證實，同時使用免疫抑制劑硫唑嘌呤（AZA）、嗎替麥考酚酯（MMF）、甲氨蝶呤（MTX）、環(huán)磷酰胺（CTX）能夠減少激素用量，縮短激素開始減量時間且可以在激素減量過程中防止疾病復(fù)發(fā)［20，22］。最近一項回顧性研究顯示：如果不用免疫抑制劑，單用激素（≤0.5 mg/kg或≥1.0 mg/kg）不能獲得完全的臨床緩解。這項研究的中位隨訪時間為（77±64）個月［23］。我們對2007年9月至2014年7月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科就診的天皰瘡患者共計234例進行回顧性分析。對系統(tǒng)應(yīng)用激素組和激素聯(lián)合非甾體免疫抑制劑組的復(fù)發(fā)率進行比較，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)應(yīng)用激素組復(fù)發(fā)率高于激素聯(lián)合非甾體免疫抑制劑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.016），復(fù)發(fā)率分別為27.4%以及14.2%。對激素聯(lián)合不同非甾體免疫抑制劑的復(fù)發(fā)率進行比較，3組不同細胞毒藥物組AZA、MTX和CTX的復(fù)發(fā)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.445），復(fù)發(fā)率分別為12.5%、15.2%、22.2%。

值得一提的是，硫唑嘌呤的代謝受到硫代嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（thiopurine methyltransferase，TPMT）活性水平的影響。TPMT活性降低與硫唑嘌呤誘發(fā)的骨髓抑制風(fēng)險增加相關(guān)。在進行硫唑嘌呤治療前，檢測TPMT基因型和（或）TPMT酶活性可能有助于預(yù)防骨髓抑制發(fā)生。在開始硫唑嘌呤治療后，所有患者均應(yīng)每隔1周進行1次血常規(guī)及肝功能檢查，持續(xù)8周，此后每3個月至少檢查1次［24-27］。

（3）生物制劑：推薦皮損累及體表面積超過30%和（或）黏膜損害嚴(yán)重的患者，或?qū)χ委煹挚梗ㄖ福航o予12周首次足量治療后疾病活動仍未控制）患者［18］，或有激素治療禁忌，或?qū)に赜袊?yán)重藥物不良反應(yīng)，應(yīng)用直接或間接針對自身抗體的治療手段，包括利妥昔單抗、靜脈用丙種球蛋白人（IVIG）。利妥昔單抗（第1天、第14天1 000 mg或者375 mg/m2靜脈滴注每周1次共4次）或靜脈用丙種球蛋白（2 g/kg每個治療周期，每4～6周1次）。2017年Lancet發(fā)表了Joly等［28］利用利妥昔單抗聯(lián)合短期潑尼松療法治療天皰瘡（82%為PV，18%為落葉型天皰瘡）的研究。試驗結(jié)果表明，相比于單獨潑尼松治療，利妥昔單抗聯(lián)合短期潑尼松療法在療效及安全性上更具優(yōu)勢。研究對象為初發(fā)未治療患者。試驗組接受利妥昔單抗及系統(tǒng)用小劑量激素，利妥昔單抗第1、14天分別系統(tǒng)用1 000 mg，第12、18個月分別系統(tǒng)用500 mg。同時聯(lián)合激素0.5～1 mg·kg-1·d-1，在3～6個月內(nèi)減量。對照組系統(tǒng)用激素1～1.5 mg·kg-1·d-1，在12～18個月內(nèi)減量。在第24個月，實驗組89%（41/46）患者停藥并獲得完全緩解，對照組15%（34/44）的患者停藥并獲得完全緩解。

（4）局部外用藥及支持治療：包括根據(jù)病情進行創(chuàng)面管理，使用避免2次損傷的創(chuàng)面敷料，使用止痛漱口水（如果有口腔黏膜累及），給予足夠的鎮(zhèn)痛劑，以及可能的營養(yǎng)素補充（如果有口腔及下咽部痛性糜爛）及定期的口腔檢查［18］。我們對27例天皰瘡患者進行局部外用強效激素治療，其臨床總有效率達70.4%（19/27）。尤其是復(fù)發(fā)的患者或者局部頑固性皮損不愈合的患者，可首先考慮加用強效激素療法，從而避免長期大劑量系統(tǒng)使用激素帶來的不良反應(yīng)。

2.維持治療：如果已經(jīng)有1～2周無新發(fā)皮損，并且有80%的皮損已經(jīng)愈合，可以進入維持治療。一旦疾病活動得到控制，則系統(tǒng)用激素開始減量。速度控制在每1～2周減量25%。低于每天20 mg，每2～4周減量25%。對于長期治療，低于每天7.5 mg后，根據(jù)疾病的活動，緩慢減量。Wang等［29］推薦了非常清晰激素減量規(guī)則，即每年減量50%，第5年減到10 mg/d，長期維持10 mg/d可以避免復(fù)發(fā)。

復(fù)發(fā)定義為：1個月內(nèi)有多于3個皮損（水皰或糜爛），不能在1周內(nèi)自行好轉(zhuǎn)；或在疾病活動控制的患者，原有皮損有進展。推薦以下治療策略：如果疾病復(fù)發(fā)，恢復(fù)到減量前的上一個劑量。如果疾病控制時間＜2周，重新開始藥物減量過程。如果恢復(fù)劑量后，疾病的活動沒有控制，恢復(fù)到首次系統(tǒng)用藥的劑量。如果需要，可以改變免疫抑制劑的種類［18］。對于復(fù)發(fā)患者，我們的經(jīng)驗是，首先考慮更換激素種類（如醋酸潑尼松更換為甲潑尼龍）或劑型（如口服激素更換為靜脈用）。另外，可考慮更換免疫抑制劑的種類以及加強外用強效激素。對于較為嚴(yán)重的患者可考慮使用靜脈用丙種球蛋白、美羅華及血漿置換。

三、結(jié)語和展望

PV是一類危重的皮膚病，由于其具有明確的自身抗原和自身抗體，已成為研究器官特異性自身免疫病的模型。隨著研究的進一步深入，新的診斷方法和治療手段應(yīng)運而生，將逐步應(yīng)用于臨床，提高診斷的正確性、積極指導(dǎo)臨床用藥；從而判斷預(yù)后、提高療效、減少并發(fā)癥、降低死亡率。目前已在全國范圍內(nèi)成立了大皰病患者的數(shù)據(jù)錄入平臺，擬通過多中心的協(xié)作，收集更多患者的診療數(shù)據(jù)。希望在不遠的將來在這個大數(shù)據(jù)診療平臺的支持下，探索出符合我國國情的診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療規(guī)范。

近年來，隨著研究進展，發(fā)現(xiàn)激素和利妥昔單抗，在抑制免疫系統(tǒng)的同時，增加了患者潛在致命性的機會性感染和腫瘤風(fēng)險。靶向治療抗原特異性B細胞一直是自身免疫性疾病的最高治療目標(biāo)。2017年，Payne等研究設(shè)計了人類T細胞表達的嵌合自身抗體受體（chimeric autoantibody y receptor，CAAR），由PV的自身抗原—Dsg3，融合cd137-cdζ信號域構(gòu)成。在體外實驗中，Dsg3 CAAR-T細胞對表達抗Dsg3 B細胞受體的細胞具有特異性殺傷性。在體內(nèi)試驗中，Dsg3 CAAR-T細胞能夠擴增，存活并特異性地消除Dsg3特異性B細胞。研究者希望進行進一步的在體實驗，如果研究成功，將成為治療PV的最有效方式［30］，更好地造福于廣大患者。

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