鮑曼不動桿菌生物膜形成機制研究進展

馬曉春， 代 軍， 徐 磊， 張仕斌， 高麗麗

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）是一種革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界，是目前醫(yī)院感染最重要的條件致病菌之一。該菌常見于重癥患者及免疫力低下人群，可引起醫(yī)院獲得性肺炎以及血流、腹腔、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和皮膚軟組織等感染，病死率高[1-2]。隨著臨床用藥的增加，鮑曼不動桿菌耐藥性有逐漸升高的趨勢，給臨床治療帶來了極大困難[3]。研究證實，臨床分離的鮑曼不動桿菌菌株幾乎都具有較強的細菌生物膜形成能力，生物膜一旦形成，細菌就具有極強的耐藥性和致病性[4-5]。Rumbo-Feal等[6]利用RNA-seq技術對生物膜狀態(tài)下和浮游狀態(tài)下的鮑曼不動桿菌mRNA表達差異進行分析發(fā)現(xiàn)，生物膜狀態(tài)下1 621條基因表達上調，且有55條基因只在固著狀態(tài)下表達。這些差異主要涉及氨基酸和脂肪酸代謝、運動性、主動運輸、DNA甲基化、鐵獲取、轉錄調控和群體感應系統(tǒng)（QS）。本文就鮑曼不動桿菌生物膜形成過程以及調控機制的最新研究進展做簡要綜述，以期為鮑曼不動桿菌生物膜的防控提供參考。

1 生物膜的結構和功能

細菌生物膜是指細菌在生長過程中黏附于生物或非生物表面后，被細菌自身產(chǎn)生的胞外多聚物基質包裹而形成的細菌群體。當細菌以生物膜形式存在時，耐藥性明顯增強（10～1 000倍），抗生素并不能有效清除細菌生物膜，還可誘導耐藥性產(chǎn)生[7]，這是臨床上難治性感染的重要原因之一。生物膜不僅利于細菌適應不同環(huán)境，有效抵制機體的防御能力，更可以抑制抗生素對細菌的殺滅作用。

2 鮑曼不動桿菌生物膜形成的調節(jié)機制

細菌生物膜的形成是一個復雜有序的動態(tài)過程，生長周期一般分為5個階段，即最初定植階段、不可逆黏附階段、生物膜早期形成階段、發(fā)展成熟階段和解聚再定植階段。研究發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動桿菌在48 h內就能夠形成成熟的生物膜[8]。目前發(fā)現(xiàn)的影響鮑曼不動桿菌生物膜形成的因素主要有：菌毛合成系統(tǒng)，BfmRS雙組分調控系統(tǒng)、細菌QS、生物膜相關蛋白（Bap）及外膜蛋白等幾個方面。除此之外，blaPER-1、O-糖基化系統(tǒng)、核糖核酸酶T2家族蛋白、pgaABCD、金屬離子濃度、藍光、乙醇和環(huán)境溫度等多種因素都可影響生物膜的形成。

2.1 菌毛合成系統(tǒng)

黏附是生物膜形成至關重要的初始階段。研究證實，鮑曼不動桿菌19606型菌株的菌毛在非生物表面黏附、微菌落形成及生物膜形成初始階段具有重要作用[9]。有6個基因（csuAB/A/B/C/D/E）參與調節(jié)菌毛合成，組成了CsuA/BABCDE菌毛合成調控系統(tǒng)。其中csuAB、csuA、csuB 3個基因編碼的菌毛的亞單位結構；csuC編碼伴侶蛋白（chaperone），參與菌毛蛋白的轉運；csuD編碼引導分子（usher），是一個具有孔道的蛋白，可以結合黏附素（adhesin）；csuE編碼黏附素分子?；騝suE是CsuA/BABCDE的重要部分，參與細菌菌毛形成、黏附和生物膜形成。菌毛的組裝分泌過程依賴csuC表達的分子伴侶引導合成系統(tǒng)（chaperone-usher pili assembly system），其中伴侶蛋白的功能是結合和穩(wěn)定菌毛亞單位，防止亞單位的水解，引導分子則可以在細菌外膜形成孔道，與伴侶蛋白協(xié)同組裝和分泌菌毛。

通過掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動桿菌19606型菌株細胞存在長、短兩種菌毛，在非生物表面黏附時兩種菌毛需同時存在[10]。但csuE突變株僅表達短菌毛，而黏附到上皮細胞的能力卻比19606型野生株強，表明對真核細胞的黏附不依賴于CsuA/BABCDE產(chǎn)生的菌毛[11]。最新研究發(fā)現(xiàn)，LH92_11085是鮑曼不動桿菌MAR002株操縱子基因的一部分，SEM和生物膜測定實驗表明該基因受抑制后導致細菌黏附到A549細胞以及在塑料表面生物膜形成能力明顯減弱[12]。透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）分析后發(fā)現(xiàn)在LH92_11085突變株上缺乏長菌毛的形成。同時，LH92_11085也與細菌毒力相關。由此可見，鮑曼不動桿菌黏附到人體上皮細胞和非生物表面的機制并不完全相同，且受多種因素影響。長、短兩種菌毛在細菌黏附到生物表面和非生物表面過程中發(fā)揮的作用仍需進一步研究。

2.2BfmRS雙組分調控系統(tǒng)

研究發(fā)現(xiàn)[13]，BfmRS雙組分調控系統(tǒng)（twocomponent regulatory systems）可以調控CsuA/BABCDE菌毛合成系統(tǒng)。該系統(tǒng)由感受器激酶BfmS和反應調控因子BfmR組成，分別由bfmS及bfmR編碼合成。bfmR位于bfmS的下游，當BfmS受信號刺激激活后，磷酸化的BfmR對csuA/BABCDE基因簇的表達進行調控，從而影響菌毛的合成分泌、細菌的黏附和生物膜的形成。當BfmS正常，而BfmR活性受抑制后，csu基因不表達，從而無法產(chǎn)生菌毛，最終導致培養(yǎng)基中細菌的黏附能力和生物膜的合成受損；而抑制BfmS活性，僅能使生物膜的形成能力下降，對下游靶基因沒有影響。這表明BfmS并非細菌生物膜合成的必需成分，BfmR也可通過其他途徑被激活。Liou等[14]也證明在感受器激酶BfmS失活的情況下，鮑曼不動桿菌ATCC 17978株生物膜形成有所減少。

2.3 細菌QS

QS是指細菌在繁殖過程中分泌一些特定的自誘導信號分子，這些信號分子感知周圍環(huán)境中自身或其他細胞群體密度的變化，并隨群體密度增加而增加，當群體密度達到一定閾值時，信號分子啟動菌體中特定基因表達，改變和協(xié)調細胞之間的行為，從而呈現(xiàn)出某種生理特性。通過QS，可以促進細胞間的信息交流，增強群體合作能力，使其更好地適應外界環(huán)境的變化。

Niu等[15]研究表明，鮑曼不動桿菌QS受abaI/abaR基因的調控，abaI基因合成自誘導分子乙酰高絲氨酸內酯（acyl-homoserine lactones，AHLs），abaR則合成AHLs的受體。abaI基因為鮑曼不動桿菌密度調控基因，除與細菌毒力與致病性有關外，主要調控細菌群體的密度，在生物膜形成過程中的后期成熟階段起重要作用，該基因失活可導致生物膜形成損害。

鮑曼不動桿菌細胞從浮游狀態(tài)向生物膜轉化過程中，細菌通過產(chǎn)生AHLs分子進行細菌間的信息交流，引起同類細菌的大量聚集。當細菌數(shù)達到臨界水平，AHLs分子達到閾值，細菌密度感應系統(tǒng)被激活，細菌不斷分泌大量胞外多糖（exopolysaccharide， EPS），EPS黏結單個細菌而形成生物膜。而Stacy等[16]證實鮑曼不動桿菌在衰減的群體感應中使用的是非N-?；z氨酸內酯，細菌通過QS可以在同種間進行相互協(xié)調，也能感知其他種間細菌數(shù)量來調控自身行為，不同菌種間相互影響，造成多重感染。AHLs作為QS信號，主要在生物膜形成的中、后期起作用。研究發(fā)現(xiàn)[17]，c-di-GMP 可作為鮑曼不動桿菌信號轉導過程中的第二信使，與細菌生物膜的形成關系密切。低濃度的外源c-di-GMP有利于細菌的運動性和毒性因子的產(chǎn)生，防止細菌黏附，抑制鮑曼不動桿菌生物膜的形成能力。c-di-GMP 對鮑曼不動桿菌生物膜的作用還需進一步研究。

Xiang等[18]認為鮑曼不動桿菌臨床菌株生物膜形成能力和厚度可能與pgaB轉錄水平有關，QS基因abaI的表達可能提高pgaB基因的表達，從而導致細胞外基質和生物膜的形成；但孫珊等[19]認為abaI基因在鮑曼不動桿菌臨床菌株中存在廣泛，并非鮑曼不動桿菌生物膜形成的唯一決定因素。

2.4Bap

鮑曼不動桿菌Bap是一類含有8 621個氨基酸的大分子表面蛋白，可以維持生物膜在非生物表面的成熟結構[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)[20]，Bap基因突變會導致鮑曼不動桿菌在玻璃表面無法維持生物膜的厚度和體積；Bap具有與細菌表面黏附素相似的結構，推測其可能通過介導細胞間黏附的方式來維持生物膜的成熟結構。SEM分析發(fā)現(xiàn)醫(yī)學材料表面生物膜三維結構和水通道形成需要Bap參與。此外，Bap也可促進鮑曼不動桿菌在人支氣管上皮細胞和新生膠質細胞上的黏附，這可能與其增強細菌表面疏水性有關[21]。

Bap存在于多種致病菌中，不同細菌的Bap在生物膜形成過程中的作用有所不同。Goh等[22]研究發(fā)現(xiàn)，90%被檢測菌株含有Bap基因且同源性較高。Bap抗體可抑制陽性株在非生物表面形成生物膜，直接證明Bap在生物膜形成過程中起作用。

GE Gregorio等[23]對541株鮑曼不動桿菌序列進行分析后發(fā)現(xiàn)，Bap具有高度多態(tài)性。按照重復序列和羧基端序列差異將Bap分為三種類型，其中29%屬于1型，40%屬于2型，11%屬于3型，另外20%缺少Bap序列。3型Bap只存在于鮑曼不動桿菌，1型和2型也可存在于其他不動桿菌屬細菌中。研究發(fā)現(xiàn)在鮑曼不動桿菌中存在2個額外蛋白BLP1和BLP2，敲除BLP1或BLP2基因后，鮑曼不動桿菌ST1 AYE株生物膜形成明顯受影響，生物膜質量和厚度均下降，同時對上皮細胞黏附也受影響。BLP1在多數(shù)3型Bap菌株中缺失，而BLP2十分保守，但多數(shù)Bap陰性菌株存在缺失。

2.5 外膜蛋白A

外膜蛋白A（outer membrane protein A，OmpA）是鮑曼不動桿菌中最豐富的三聚體外膜孔蛋白，是外膜蛋白的主要成分，主要作用是維持外膜完整性，與細胞黏附、生物膜形成及免疫應答密切相關。Gaddy等[24]研究表明，OmpA對生物膜的形成和發(fā)展是非必需的，但在聚苯乙烯表面形成堅固的生物膜需要OmpA，OmpA的失活會導致細菌細胞壁明顯改變，這可能是由于外膜的不穩(wěn)定性造成，并且該過程不依賴CsuA/BABCDE介導的菌毛合成。另外，OmpA也介導鮑曼不動桿菌對人上皮細胞和白念珠菌絲的黏附過程[25]。除了參與細胞黏附外，OmpA還是一種毒力因子，可定位至線粒體產(chǎn)生活性氧，從而誘導上皮細胞死亡，樹突狀細胞的早發(fā)性凋亡和遲發(fā)性壞死[26]。此外，OmpA在鮑曼不動桿菌耐藥過程中發(fā)揮作用，OmpA基因被破壞后使多種藥物對鮑曼不動桿菌的MIC降低[27]。

2.6 blaPER-1基因

Lee等研究證實，超廣譜β內酰胺酶基因blaPER-1的表達，與鮑曼不動桿菌在支氣管上皮細胞和塑料表面的黏附能力及生物膜形成能力正相關。這種相關性是鮑曼不動桿菌可以持續(xù)存在于醫(yī)療環(huán)境、人類宿主，甚至在廣泛使用抗菌藥物時的重要機制；另一方面，Rao等[29]研究表明含有blaPER-1基因的11株菌株中僅有2株比缺乏該基因的菌株生物膜生成能力強，blaPER-1對細胞黏附作用比生物膜形成作用更重要。由此可見，blaPER-1對細胞黏附作用肯定，但由于生物膜形成影響因素不是唯一的，無法衡量該基因對鮑曼不動桿菌生物膜形成過程中的地位。

2.7O-糖基化系統(tǒng)

在鮑曼不動桿菌ATCC 17978株中，O-糖基化（O-glycosylation）系統(tǒng)也被證明可增加生物膜的形成能力，糖基化促進最初的黏附和增強成熟生物膜的質量和密度，推測多聚糖蛋白在細胞間黏附中起作用[30]。pglC突變可阻止糖蛋白和被膜的合成，從而導致生物膜結構異常以及對小鼠毒性減弱。進一步研究證實，pglC突變后導致生物膜結構粗糙和混亂，推測這種莢膜多聚糖可能與生物膜的組織和構造相關[31]。

2.8 核糖核酸酶T2家族蛋白

核糖核酸酶T2家族蛋白能促進鮑曼不動桿菌的黏附和能動性，從而促進生物膜的形成，但具體機制尚不明確。當鮑曼不動桿菌ATCC17978菌株核糖核酸酶T2蛋白編碼區(qū)被干擾后，其在非生物材料表面的定植與親本菌株相比顯著減少[32]。

除此之外，pgaABCD、金屬離子濃度、藍光、乙醇和環(huán)境因素等多種因素都可影響生物膜的形成[33]。

3 結論與展望

鮑曼不動桿菌生物膜的形成是一個眾多因素參與調控的復雜過程：鮑曼不動桿菌浮游細胞在內、外信號的刺激下，通過激活BfmRS系統(tǒng)促進CsuA/BABCDE基因簇的表達而合成分泌細菌菌毛，細菌利用菌毛和外膜蛋白不穩(wěn)定黏附于生物/非生物表面，然后通過AHLs分子進行相互間的信息交流，引來同類細菌聚集，同時細菌產(chǎn)生大量的EPS，并在Bap分子作用下形成微菌落，不斷增厚的微菌落最終形成一個緊密結合、相互連接的三維聚合物網(wǎng)狀結構，形成成熟的生物膜。成熟的生物膜在內在的調節(jié)機制或在外部沖刷力等作用下可部分解聚脫落，轉變?yōu)楦∮紊L狀態(tài)，再黏附到基質表面形成新的生物膜。

隨著人們對鮑曼不動桿菌生物膜形成環(huán)節(jié)認識的加深，利用藥物、抗菌肽以及醫(yī)用生物材料改良等方法在生物膜清除實驗中取得了顯著進展。最近研究發(fā)現(xiàn)，一種用于治療霍亂弧菌的藥物virstatin通過抑制菌毛合成從而減少生物膜的形成[34]。由于細菌生物膜的形成受多因素影響，許多機制尚不十分清楚，需要進一步研究。目前，鮑曼不動桿菌的生物學信息已經(jīng)進入基因組和后基因組時代，今后可以在基因水平、蛋白水平探討生物膜形成的機制，從而為抑制生物膜形成提供新的思路和防控策略。

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