牛傳染性鼻氣管炎病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國(guó)，劉吉山，張 穎，莫 玲，姚春陽(yáng)

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

牛傳染性鼻氣管炎（Infectious bovine rhinotracheitis，IBR）又稱壞死性鼻炎（Necrotis rhinitis，NR）或紅鼻?。≧ed nose disease，RND），是由皰疹病毒科的牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）引起的牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病，臨床上以高熱、呼吸困難、鼻炎、鼻竇炎為主要特征。以20～60日齡的犢牛最為易感，6周齡以下的犢牛病死率可達(dá)85%～100%。IBRV又稱為牛皰疹病毒 1型（Bovine herpesvirustype 1，BHV-1），具有典型的泛嗜性，能侵襲牛的多種組織和器官，引起鼻氣管炎、膿皰性外陰-陰道炎、龜頭-包皮炎、母牛流產(chǎn)和死胎、乳房炎、子宮內(nèi)膜炎、腸炎、結(jié)膜炎和犢牛腦膜腦炎等多種疾病。IBRV侵入牛體后，以潛伏感染和持續(xù)性感染為特征，影響牛的生產(chǎn)力，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

牛傳染性鼻氣管炎首次發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)50年代，在美國(guó)羅拉多州發(fā)現(xiàn)了以傳染性鼻氣管炎癥狀為特征的疾病，隨后在洛杉磯和加利福尼亞州等地也相繼出現(xiàn)，我國(guó)于1980年首次從新西蘭進(jìn)口奶牛中檢測(cè)到病毒并分離出來。該病呈現(xiàn)世界性流行，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為B類傳染病，也是我國(guó)進(jìn)出境動(dòng)物和國(guó)際動(dòng)物貿(mào)易中規(guī)定的重點(diǎn)檢疫對(duì)象。本病目前尚無特效治療藥物，疫苗接種和撲殺是當(dāng)前主要的防控措施，因此建立快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，顯得尤為重要。本文綜述了IBRV的最新實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展，以期為IBR的診斷和防控提供參考。

1 病毒分離與鑒定

1.1 病毒的分離鑒定

IBRV能在多種原代或傳代細(xì)胞中生長(zhǎng)，如牛腎、胚胎皮膚、腎上腺、甲狀腺、睪丸、肺、鼻甲或氣管等均可生長(zhǎng)，目前較為普遍應(yīng)用的是牛腎傳代細(xì)胞（MDBK）和牛氣管傳代細(xì)胞（BTC）。臨床上，根據(jù)病牛不同的臨床癥狀，采集的樣品也不同：呼吸道型病例主要是采集患病初期病牛的鼻液或眼分泌物；母牛生殖道型病例采集外陰部黏膜和陰道分泌物，公牛生殖道型病例采集精液和包皮的生理鹽水沖洗物；流產(chǎn)型病例可收集胎兒胸腔液或肺等實(shí)質(zhì)臟器；腦膜腦炎型病例可采集腦組織。將根據(jù)不同臨床癥狀收集的病料接種到MDBK細(xì)胞上培養(yǎng)3～5 d，觀察細(xì)胞病變（CPE）。病料感染MDBK后如果產(chǎn)生細(xì)胞圓縮，呈葡萄樣聚集，形成空洞，多核巨細(xì)胞等典型CPE，可初步診斷為IBRV感染，可進(jìn)行中和試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)，或電鏡觀察病毒粒子進(jìn)一步鑒定。李琳琳等［1］、王延濤［2］利用 MDBK 細(xì)胞分別從牛鼻咽分泌物和陰道分泌物中分離并鑒定出一株IBRV。MDBK病毒分離方法可靠，但缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且分離過程比較復(fù)雜，因此在臨床中不便推廣應(yīng)用。

1.2 包涵體檢查

將IBRV接到MDBK等易感細(xì)胞上，待細(xì)胞出現(xiàn)CP E后用Lendrum染色法染色，鏡下觀察可見細(xì)胞核被染成藍(lán)色，膠原染成黃色，特征性核內(nèi)包涵體被染成紅色。也可采取病牛病變部位的上皮組織（鼻腔、眼結(jié)膜、角膜等組織）制成切片后染色、鏡檢。

2 血清學(xué)檢測(cè)方法

2.1 病毒中和試驗(yàn)（VN）

中和試驗(yàn)是最經(jīng)典、最標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)血清抗體的方法，是OIE指定方法之一。王延濤［2］將抗IBRV陽(yáng)性血清中和分離到的毒株，進(jìn)行了進(jìn)一步的PCR檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)，標(biāo)準(zhǔn)毒株與分離毒株的擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致。病毒中和試驗(yàn)的缺點(diǎn)是耗資費(fèi)力、操作繁瑣、試驗(yàn)周期長(zhǎng)、對(duì)操作人員的操作熟練程度要求較高、不適用于大批量的樣本檢測(cè)。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA法具有敏感、快速、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于IBRV的檢測(cè)，也為OIE指定方法之一。ELISA方法有多種，以間接ELISA最為常用。IBRV具有良好免疫原性的蛋白主要有g(shù)B、gC、gD、gE和gG，這些蛋白已先后被作為IBRV檢測(cè)的靶蛋白，用于建立ELISA方法，并顯示出較好的檢測(cè)效果。朱元茂等［3］、楊娟［4］先后建立了IBRV全病毒作為檢測(cè)抗原的間接ELISA方法。李兆利等［5］、李偉等［6］、吳春濤等［7］、曹翀等［8］先后建立了檢測(cè)IBRV gB抗體的間接ELISA方法。祖立闖等［9］、董華興等［10］、陳婷［11］、宋玲玲［12］、齊曉雪［13］等先后建立了檢測(cè)IBRV gD抗體的間接ELISA方法。王海燕等［14］、Bertolotti等［15］先后建立了檢測(cè)IBRV gE抗體的間接ELISA方法。顏邦芬［16］建立了檢測(cè)IBRV gG抗體的間接ELISA方法。石建平［17］建立了檢測(cè)gB3抗體的阻斷ELISA。王冰［18］建立了檢測(cè)IBRVgG抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。馬輝等［19］、周躍輝［20］分別制備了 gC 和 gD 的特異性單克隆抗體并建立了雙抗體夾心ELISA方法。Casarin等［21］建立了一個(gè)基于抗生物素蛋白-核酸的組裝體（ANANAS）技術(shù)的新型ELISA方法，這是一種基于納米顆粒級(jí)別的膠狀多聚抗生物素蛋白新型的用于免疫診斷學(xué)的信號(hào)放大平臺(tái)，可廣泛應(yīng)用于疾病診斷程序中。

2.3 間接血凝試驗(yàn)（IHA）

IHA是一種簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)血清抗體的方法。陳天祥等［22］、楊春明［23］先后建立了 IBRV 的 IHA 方法，并取得較好效果。但I(xiàn)HA方法受諸多客觀因素的限制，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

2.4 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）

AGP即可檢測(cè)抗體，也可檢測(cè)抗原。該方法操作簡(jiǎn)單，成本較低，但由于其敏感性較低，只有當(dāng)感染?？贵w呈現(xiàn)很高滴度才能檢出，不適用于疾病的根除，應(yīng)用價(jià)值受到限制。

2.5 間接免疫熒光（IFA）

IFA主要用于檢測(cè)抗原。通常將抗牛免疫球蛋白第二抗體與異硫氰熒光素連接成熒光抗體，加到接有IBRV的細(xì)胞培養(yǎng)物中，置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。該法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，其敏感性也低于病毒分離。

2.6 膠體金技術(shù)

膠體金技術(shù)簡(jiǎn)單快速，適合大量樣品的臨床檢測(cè)。石建平［17］用膠體金標(biāo)記IBRV單抗檢測(cè)IBRV，其研制試紙條與PCR的陰性符合率99.17%。王武軍等［24］建立了斑點(diǎn)免疫金滲濾法（DIGFA）檢測(cè)IBRV抗體，僅需5 min即可判斷結(jié)果。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

3.1 RT-PCR

RT-PCR方法具有敏感、特異、快速等特點(diǎn)，已被廣泛用于檢測(cè)人工感染或自然感染牛精液、血清或組織樣品中的 IBRV。張桂紅等［25］、林梅等［26］先后根據(jù) IBRV TK基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了可鑒別IBRV TK基因缺失株與野毒株的 PCR 方法。徐淑菲等［27］、楊少華等［28］、王嵩等［29］、王吉等［30］先后根據(jù) IBRV gB 基因序列設(shè)計(jì)引物建立了PCR方法。鄧碧華等［31］根據(jù)IBRV的gB和gE基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，建立了套式PCR方法，能夠檢測(cè)IBRV及有效區(qū)分IBRV野毒株和gE基因缺失疫苗株。王冰等［32］根據(jù)IBRV gD基因序列設(shè)計(jì)引物建立了PCR方法。王冰等［33］根據(jù)gG基因設(shè)計(jì)引物，建立了一種既能快速檢測(cè)IBRV，又能區(qū)分同屬病毒牛皰疹病毒5型（BHV-5）和偽狂犬病病毒（PRV）的PCR方法，在牛皰疹病毒感染診斷和標(biāo)記疫苗免疫后的鑒別診斷方面具有良好的應(yīng)用前景。范晴等［34］建立了同時(shí)檢測(cè)牛支原體（MB）、牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒（BVDV）和IBRV的三重二溫式PCR方法，可鑒別診斷3種疾病，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

3.2 熒光定量RT-PCR

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR比普通RT-PCR具有更高的敏感性和特異性，為IBRV感染的快速檢測(cè)提供了一種新的方法。唐泰山等［35］根據(jù)IBRV的gB和gE基因序列，分別設(shè)計(jì)2對(duì)引物及其相應(yīng)的TaqMan探針，建立了檢測(cè)IBRV和區(qū)分gE基因缺失疫苗株及野毒株的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法。孫志明等［36］根據(jù)IBRV gE基因保守序列設(shè)計(jì)引物，建立了IBRV gE基因的SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，為鑒別IBRV野毒株和gE基因缺失疫苗株的感染提供了技術(shù)手段。蔣珊珊等［37］、徐娜等［38］分別根據(jù) IBRV gB 和 gE設(shè)計(jì)2對(duì)引物及相應(yīng)的TaqMan探針，建立了TaqMan熒光定量RT-PCR方法。用以檢測(cè)IBRV及鑒別gE基因缺失疫苗株和野毒株。喬波等［39］、王海軍等［40］根據(jù)IBRV gB基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了IBRV的TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，適用于臨床疑似樣品的快速定量檢測(cè)。張喜喜等［41］根據(jù)IBRV gB基因序列設(shè)計(jì)引物及相應(yīng)探針，分別建立了TaqMan探針與SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR方法，經(jīng)對(duì)2種方法的敏感性等綜合比較，發(fā)現(xiàn)2種檢測(cè)方法無顯著差異。

3.3 環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP）

RT-LAMP技術(shù)是建立在RT-PCR基礎(chǔ)上的一種新型核酸檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)便、快速高效、敏感性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適合基層業(yè)務(wù)部門及養(yǎng)殖場(chǎng)的檢測(cè)，為IBRV感染的快速檢測(cè)提供了新方法。馮蒙［42］針對(duì)IBRV gB基因設(shè)計(jì)LAMP引物，建立了可用于檢測(cè)IBRV的RTLAMP方法，與套式RT-PCR法對(duì)樣品的檢測(cè)結(jié)果的總符合率92.4%。皇甫和平等［43］建立了IBRV gE基因的RT-LAMP檢測(cè)方法，對(duì)臨床采集的50份奶牛鼻腔拭子DNA進(jìn)行了檢測(cè)，可用于IBRV分離株的鑒定以及臨床樣品的快速檢測(cè)。郭利等［44］建立了IBRV gE基因的RT-LAMP技術(shù)。每微升反應(yīng)體系中可檢測(cè)到2.23×103拷貝的病毒基因含量。郭利等［45］應(yīng)用金納米顆粒與PCR結(jié)合建立了納米PCR（nano-PCR）新型檢測(cè)方法和LAMP可視化檢測(cè)方法，并與普通PCR方法進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果顯示，nano-PCR方法敏感性是普通PCR的100倍；LAMP樣品檢測(cè)用時(shí)最短，50 min即可得到檢測(cè)結(jié)果。nano-PCR敏感性和特異性更適合于臨床樣品的檢測(cè)，可與LAMP配合使用，對(duì)IBRV的篩查和預(yù)防提供技術(shù)支撐。

3.4 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)具有高度特異、敏感、快速等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于病毒感染的檢測(cè)。吳時(shí)友等［46］用32P標(biāo)記制備的探針可檢出10 pg的IBRVDNA，能明顯區(qū)分IBRV感染細(xì)胞和未感染的正常細(xì)胞。隨后他用生物素代替32P制備的探針也取得了較好結(jié)果，能檢測(cè)牛精液中IBRV DNA。

3.5 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)檢測(cè)疾病具有高通量、并行性和結(jié)果判讀客觀、準(zhǔn)確和信息化等特點(diǎn)。季新成［47］將標(biāo)有CY3的PCR產(chǎn)物與芯片上包被的寡核苷酸探針雜交，對(duì)IBRV質(zhì)粒的檢測(cè)靈敏度達(dá)到103拷貝/反應(yīng)，而他又建立了IBRV的懸浮液態(tài)芯片檢測(cè)技術(shù)，對(duì)IBRV的靈敏度為103拷貝/反應(yīng)，具有較好的可重復(fù)性和特異性。陳圣軍等［48］根據(jù) IBRV gB 基因和赤羽病病毒（AKAV）S基因序列設(shè)計(jì)合成了2對(duì)特異引物和探針，建立了同時(shí)檢測(cè)這2種病毒的基因芯片檢測(cè)方法，從而實(shí)現(xiàn)了進(jìn)行1次試驗(yàn)即可對(duì)IBRV和AKAV兩種病毒達(dá)到快速準(zhǔn)確檢測(cè)的目的。

4 小結(jié)

近年來，我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)正向集約化、規(guī)?；杆侔l(fā)展，國(guó)內(nèi)外活畜和遺傳物質(zhì)貿(mào)易日益頻繁，這給IBR的流行與傳播創(chuàng)造了良好條件?，F(xiàn)有資料表明，本病在我國(guó)已呈現(xiàn)高度蔓延趨勢(shì)，養(yǎng)牛業(yè)已遭受巨大損失。目前我國(guó)防制IBR還處在監(jiān)測(cè)、撲殺、隔離的階段，還沒有配套的疫苗免疫及根除計(jì)劃，因此加強(qiáng)病原檢測(cè)技術(shù)和方法的研究對(duì)預(yù)防和控制該病具有非常重要的意義。綜上所述，雖然IBRV的檢測(cè)方法多種多樣，技術(shù)在不斷的革新和完善，但是每種方法均具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)和實(shí)用性，在實(shí)際中應(yīng)根據(jù)具體情況選擇適宜的方法。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，IBRV的檢測(cè)會(huì)向著更加敏感、特異、快速、簡(jiǎn)便、高效的方向發(fā)展，并在IBR的控制與凈化中發(fā)揮重要作用，從而達(dá)到根除的目的。