北美冬青“奧斯特”的組織培養(yǎng)和快速繁殖研究

王 濤

（新疆林科院園林綠化研究所，新疆 烏魯木齊 830063）

1 北美冬青‘奧斯特’的組織培養(yǎng)

植物組織培養(yǎng)又叫離體培養(yǎng)，是利用從植物體分離出符合需要的組織、器官或細(xì)胞，原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進(jìn)行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他產(chǎn)品的技術(shù)，也指在培養(yǎng)過程中從各器官上產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織再經(jīng)過再分化形成再生植物的技術(shù)。利用組織培養(yǎng)進(jìn)行冬青植物的離體培養(yǎng)和快繁已有一定成效。

1.1 選擇合適的外植體

選擇本研究所自行種植的地栽苗優(yōu)質(zhì)雌株，并選擇當(dāng)年生的、健壯的、沒有病蟲害的枝條，去掉葉片，保留2cm左右的葉柄，利用濕潤的報(bào)紙包裹保濕，保存在4℃的冰箱中。

1.2 外植體的處理和誘芽培養(yǎng)

將保存的枝條截開成莖段，保證每個(gè)莖段帶有芽節(jié)，使用飽和的洗衣粉溶液浸泡90min，并置于攪拌器上旋轉(zhuǎn)30min，用流水沖洗20min，使用75%的酒精溶液浸泡1min，并用汞溶液消毒，使用無菌水清洗5次，然后放在接種盤中風(fēng)干，之后將每個(gè)莖段兩端各自切去0.5cm，形成1.0～1.5cm長(zhǎng)的帶有0.5～1.0cm葉柄的莖段，接種到誘芽培養(yǎng)基上。

1.3 增殖培養(yǎng)

將誘芽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出的無菌苗切割成0.5～1.0cm的單芽或頂芽，然后接種到不同生長(zhǎng)物質(zhì)配比的增值培養(yǎng)基中，每次培養(yǎng)10瓶，每瓶接種5個(gè)莖段或頂芽，重復(fù)進(jìn)行3次，培養(yǎng)25d后，觀察試管苗的生長(zhǎng)狀況，選出最適合的生長(zhǎng)物質(zhì)配比。

1.4 生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)基中收獲的生長(zhǎng)狀況最好的芽苗移植到生根培養(yǎng)基中，選擇標(biāo)準(zhǔn)是生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致、長(zhǎng)度在1.5～2.0cm的組培苗嫩莖，接種到不同生長(zhǎng)物質(zhì)配比的生根培養(yǎng)基中，每個(gè)處理10瓶，每瓶接種10個(gè)嫩莖，重復(fù)培養(yǎng)3次。培養(yǎng)結(jié)果判定培養(yǎng)30d后觀察生根數(shù)，出現(xiàn)2條以上視為有效根，計(jì)算生根率。

所有外植體誘芽培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)均設(shè)置不加生長(zhǎng)物質(zhì)的對(duì)照試驗(yàn)，并在25℃左右，光照強(qiáng)度40μmol·m-2·s-1的條件下培養(yǎng)，并每天保證12h的光照。

2 無菌快繁體系的建立

沒有被污染且成功成活的外植株，接種1周后也并逐漸出現(xiàn)松動(dòng)，最終脫落，腋芽出現(xiàn)膨脹，10d后可看到冒出的嫩芽，25d后腋芽伸長(zhǎng)并且長(zhǎng)出葉片，并以單芽生長(zhǎng)為主，培養(yǎng)40d后嫩莖逐漸生長(zhǎng)到3～4cm。將長(zhǎng)成的嫩莖切割成小部分，接種在同樣的誘芽培養(yǎng)基上，經(jīng)過連續(xù)2～3次的繼代培養(yǎng)，腋芽逐漸分化出叢生芽，叢生芽的繁殖能力很強(qiáng)，因此，無菌無性體系群體會(huì)逐漸擴(kuò)大，形成無菌快繁體系。

另外，在培養(yǎng)外植體時(shí)，誘芽培養(yǎng)基上除了嫩莖之外，還形成了愈傷組織，在切割嫩莖進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)，將這些愈傷組織切除干凈，轉(zhuǎn)入到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，30d后會(huì)同樣收獲3～4cm高度的嫩莖，嫩莖部依然會(huì)出現(xiàn)致密的愈傷組織，再次重復(fù)上述操作，也會(huì)有同樣收獲。反復(fù)培養(yǎng)6次后，統(tǒng)共收獲嫩莖7次，時(shí)間持續(xù)多半年。而在第4次收獲后，嫩莖顏色逐漸變黃，而且愈傷組織也逐漸變小，最后一次收獲后，嫩莖細(xì)小，葉片泛黃，愈傷組織呈黃褐色，再次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)不再生長(zhǎng)嫩莖，而是死亡。

3 不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)配比對(duì)北美冬青繼代增殖的影響

繼代增殖選擇的是莖段切割的方式，選擇經(jīng)過2～3次芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的擴(kuò)大群體中長(zhǎng)勢(shì)較好的莖段進(jìn)行接種。根據(jù)觀察不同生長(zhǎng)物質(zhì)配比條件下莖段的生長(zhǎng)形勢(shì)，發(fā)現(xiàn)接種在WPM+6-BA1.50mg/L+0.10NAA mg/L+蔗糖20g/L的培養(yǎng)基上的增值系數(shù)最大，即培養(yǎng)后獲得的芽數(shù)與接種時(shí)的芽數(shù)的比值最大，長(zhǎng)勢(shì)最好。但是此配比條件下，繼代培養(yǎng)的組培苗有玻璃化現(xiàn)象出現(xiàn)。此時(shí)如果將6-BA的濃度降低到1.000mg/L時(shí)，莖段的增值系數(shù)不變，但玻璃化現(xiàn)象消失。所以，最適合的增值培養(yǎng)基的生長(zhǎng)物質(zhì)配比為WPM+6-BA1.00mg/L+0.10NAA mg/L+蔗糖20g/L，此時(shí)增值系數(shù)最大，且芽苗健壯，顏色濃綠，生機(jī)勃勃。

4 結(jié)語

‘奧斯特’是北美冬青適合在我國地理環(huán)境條件下生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)品種，有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值，因此，研究其組織培養(yǎng)技術(shù)，和無菌快繁體系的建立，并尋找最適合繼代增值培養(yǎng)的生長(zhǎng)物質(zhì)配比條件，從而為‘奧斯特’的大量繁殖創(chuàng)造條件。