糖化作用刺激體外重建全層皮膚模型中單核細胞分化

晚期糖化終末產物（AGEs）是由蛋白質或脂質與糖（如葡萄糖和核糖）通過非酶糖化反應形成的，是公認與自然老化相關機制之一。皮膚生物學研究認為，糖化作用對與真皮基質分子影響皮膚老化的硬化有關，可能是由改變分子間交聯(lián)所致；有研究在糖尿病和老化皮膚中檢測到AGEs蓄積。有文獻報道，AGE沉積可使皮膚生物化學特性和功能均發(fā)生變化。AGEs通過改變細胞外基質和細胞內蛋白質，可影響皮膚自穩(wěn)態(tài)和皮膚常駐細胞的功能。

AGE具有結合特異性膜蛋白能力，其中最著名且研究最多的為RAGE（AGE受體），該受體除了能與AGE結合，還能與參與炎癥反應的S100蛋白、HMGB?1和Mac?1相互作用。AGE?RAGE結合可引起一種循環(huán)激活作用，即導致炎癥性NFκB誘導的活化與RAGE上調之間的交互對話。這種激活作用可以增加促炎和促纖維化細胞因子和趨化因子的基因轉錄。角質形成細胞除外，RAGE可在不同類型的真皮細胞中表達，包括單核細胞/巨噬細胞、T淋巴細胞、內皮細胞、系膜細胞和成纖維細胞。有文獻報道，在應對AGE修飾的細胞外基質時，成纖維細胞或角質形成細胞低表達RAGE，這些細胞能夠表達其他AGE受體（如CD36）。其他AGE受體，如A類清道夫受體（SRA）；可在樹突細胞、巨噬細胞和內皮細胞中表達。還有研究指出，SRA與RAGE之間存在交互作用，兩種受體之間的拮抗在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制中發(fā)揮了作用。SRA過表達可抑制RAGE誘導的MAPK信號通路。反之，在缺乏SRA情況下，巨噬細胞中RAGE的激活有利于促炎反應出現(xiàn)。

當皮膚內穩(wěn)態(tài)被破壞時，外周血中CD14+單核細胞進入真皮并分化為樹突細胞和巨噬細胞。根據(jù)局部環(huán)境，這些細胞極化為促炎功能的M1巨噬細胞（CD68high）或具有組織重構、抗炎功能的M2巨噬細胞（CD163+、CD68low）。目前已經(jīng)重新審視了常駐皮膚免疫細胞在皮膚內穩(wěn)態(tài)中的作用，而該研究則旨在探討老化進程中糖化作用與皮膚免疫細胞之間可能的相互作用。除了有研究報道AGEs具有延遲單核細胞凋亡，并誘導單核細胞向巨噬細胞形態(tài)分化的作用之外，關于皮膚環(huán)境中AGEs參與單核細胞分化進程的相關報道尚少。

為了解決這一問題，該研究整合了外周血CD14+單核細胞的體外重建全層皮膚模型（簡稱“重建皮膚模型”）中，探討了糖化的真皮細胞外基質對單核細胞分化的影響，即為了應對環(huán)境條件的變化，單核細胞可能分化為樹突細胞（BDCA1/CD1c、DC?LAMP/CD208）或巨噬細胞（DC?SIGH/CD209、CD68、CD163），并特別關注了巨噬細胞的極化分型。為了評價糖化基質條件下重建皮膚模型的生物學相關性，該研究對兩個不同年齡組（年輕組，18～25歲；老年組，70～75歲）女性的日光防護部位皮膚活檢樣本的糖化狀態(tài)和樹突細胞或巨噬細胞數(shù)量進行了分析。

該研究在重建皮膚模型中首次證實，AGEs的存在可能是促進樹突細胞和巨噬細胞分化的重要因素亦影響炎癥過程。

一、材料和方法

（詳見原文）

二、結果

1.在單核細胞存在的條件下，真皮等效物及重建全層皮膚模型形態(tài)和糖化作用的影響：該研究分別對真皮等效物和重建皮膚模型的形態(tài)學進行了觀察。組織學檢查結果顯示，使用預糖化膠原蛋白構建的真皮等效物的形態(tài)與非糖化膠原蛋白構建的真皮等效物存在輕微差異，前者的膠原纖維特征更為明顯。在真皮中，膠原蛋白沒有被糖化修飾時，單核細胞保持球形狀態(tài)。相反，當存在糖化膠原蛋白時，單核細胞似乎失去了它們的圓形結構，呈現(xiàn)出細長外觀，這種形態(tài)的變化與表皮是否存在無關。在非糖化修飾或糖化修飾的膠原蛋白構建的真皮等效物中，無論單核細胞是否存在，重建皮膚模型的表皮形態(tài)和厚度均無變化。使用特異性抗體可以在糖化的重建皮膚模型的真皮明確地鑒定出CML AGE，但在非糖化時不能發(fā)現(xiàn)。

2.真皮AGEs增強重建的全層皮膚模型內單核細胞的分化：免疫檢測結果顯示，如同在正常皮膚一樣，在重建皮膚模型的真皮中均能夠觀察到被添加的CD45+和CD14+細胞。在缺乏糖化作用情況下，可以觀察到有限的CD14+單核細胞分化為樹突樣細胞（BDC1a+、DC?LAMP+）或巨噬細胞樣細胞（CD14+、DC?SIGN+、CD68+、CD163+）。而伴隨著糖化作用，CD14+單核細胞，BDC1a+、DC?LAMP+樹突細胞，以及 DC?SIGN+、CD68+和CD163+巨噬細胞數(shù)量增加。無論在糖化或非糖化狀態(tài)下，重建的全層皮膚模型單位內CD45+細胞數(shù)量占比約為15～20%時，除了DC?SIGN之外（趨向而非統(tǒng)計學意義），所有其他待檢測的細胞數(shù)在糖化和非糖化狀態(tài)下的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。此外，在表皮內未檢測到陽性細胞。該結果表明，糖化狀態(tài)的確有助于血單核細胞分化為重建皮膚模型真皮中樹突細胞和（或）巨噬細胞。

3.真皮內巨噬細胞數(shù)量隨年齡的增長而增加：對年輕人和老年人組的皮膚活檢樣本進行對比分析。觀察到AGEs隨年齡增長在皮膚內出現(xiàn)蓄積，且DC?SIGN+、CD163+陽性巨噬細胞細胞數(shù)量呈年齡相關性增加。值得注意的是，在預糖化膠原蛋白存在的條件下，重建皮膚模型中這兩種標志物也增加。該結果提示，AGEs隨年齡的增加與刺激單核細胞分化為樹突細胞和巨噬細胞表型之間可能存在關聯(lián)。

4.AGEs受體在單核細胞系中表達，在成纖維細胞中不表達：研究結果顯示，在非糖化或糖化的重建皮膚模型中，RAGE和SRA這兩種AGEs受體幾乎在所有的CD14+細胞中均有表達，而在成纖維細胞（CD14-）中罕有表達。

三、討論

該研究發(fā)現(xiàn)，外周血CD14+單核細胞在體外皮膚環(huán)境中能夠分化為樹突細胞和巨噬細胞。該研究通過直接添加CD14+單核細胞，并在非糖化或在預糖化的膠原蛋白存在的條件下將其與成纖維細胞共培養(yǎng)，來獲得真皮等效物，隨后添加角質形成細胞之后獲得重建的全層皮膚模型。預糖化膠原蛋白可以使更多的單核細胞存活并分化為樹突細胞或巨噬細胞。該研究通過這種重建皮膚模型首次證實，在AGEs存在的情況下，能夠維持和影響真皮內單核細胞衍生（CD45+、CD14+）細胞數(shù)量。該體外結果與那些隨年齡增長而在人類皮膚中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象具有相關性。實際上，有研究者發(fā)現(xiàn)真皮內單核細胞衍生的細胞數(shù)隨年齡增長而增加。這些來自于單核細胞系的細胞能夠通過成纖維細胞合成的幾種因子而保留在真皮內。已有研究證實，AGEs對單核細胞可以產生趨化作用，亦有報道表明與AGEs接觸的內皮細胞可以釋放趨化因子MCP?1（單核細胞趨化蛋白1）。同樣，AGEs可以延遲人外周血單核細胞的凋亡，反之能夠促進這些細胞及其衍生細胞在組織中的蓄積。在AGEs存在的條件下，單核細胞系細胞似乎遵從向樹突細胞和巨噬細胞分化的路徑。該研究證實，由預糖化膠原蛋白構建而成的重建皮膚模型中的BDC1A+（未成熟的樹突細胞和巨噬細胞）、DC?LAMP+（成熟的樹突細胞）和DC?SIGN+、CD68+和CD163+（巨噬細胞）比對照組（非糖化）有所增加。在部分人皮膚中也可以發(fā)現(xiàn)由老化引起的這類改變。同樣，還有報道描述了AGEs對單核細胞轉化為成熟樹突細胞的影響，以及單核細胞分化為不同表型巨噬細胞的影響。在受到AGEs的刺激后，單核細胞和巨噬細胞能夠合成炎癥因子或促炎性細胞因子（如白介素1?β、白介素8、腫瘤壞死因子α或前列腺素E2），或增加由基質金屬蛋白酶（如MMP?9）誘導的細胞外基質的降解。在該研究的重建皮膚模型中發(fā)現(xiàn)，RAGE和SRA這兩種AGEs受體在CD14+細胞上呈現(xiàn)高表達。已有報道表明，這些受體尤其是RAGE，存在于單核細胞或巨噬細胞的表面，可誘導MMPs和炎癥因子的分泌。在未來將進一步對這些受體進行研究。相對于短期2D的單層細胞培養(yǎng)，該研究中3D共培養(yǎng)21 d的重建皮膚模型不僅可以實現(xiàn)單核細胞分化為促炎M1巨噬細胞，還能夠實現(xiàn)其分化為具有重構功能的M2巨噬細胞，提供了一個更接近于體內研究的生理狀態(tài)。這表明微炎癥過程與重構過程是一分為二的狀態(tài)，這兩種效應均存在于慢性炎癥過程中，且在皮膚老化中也有報道。

該研究證實，單核細胞系的CD14+細胞能夠分化為樹突細胞或巨噬細胞，這一過程會受到真皮糖化狀態(tài)的影響。鑒于這些事實，明確這些單核細胞衍生的細胞在皮膚中是否真正對慢性微炎癥過程有幫助，或者是否通過分泌抗炎性可溶因子，如IL10選擇性維持自穩(wěn)態(tài)會很有意思。

［陳旭 周治君摘自Pageon H,Zucchi H,Rousset F,et al.Glycation stimulates cutaneous monocyte differentiation in reconstructed skinin vitro［J］.Mech Ageing Dev,2017,162:18?26.］