第三代EGFR-TKIs耐藥之初探

倪蓮芳 聶立功

肺癌是全球威脅人類生命健康最大的惡性腫瘤，在我國(guó)也是如此，其發(fā)病率和病死率占所有惡性腫瘤的18.74%和25.24%，并有逐年上升的趨勢(shì)[1]。但是肺癌預(yù)后并不盡如人意，5年生存率僅17%[2]，主要是因?yàn)榇蠖鄶?shù)肺癌在診斷時(shí)已經(jīng)是局部晚期或晚期，失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。當(dāng)前在內(nèi)科治療方面，包括化療、靶向治療和免疫治療均取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，尤其是在表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）敏感突變的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）更是如此，第一代和第二代表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）已成為EGFR突變陽(yáng)性晚期NSCLC患者的標(biāo)準(zhǔn)一線治療。目前我們可以在第一代EGFR-TKIs出現(xiàn)耐藥后進(jìn)行檢測(cè)，選擇應(yīng)用第三代EGFR-TKIs。新近的FLAURA研究顯示[3]，第三代EGFR-TKI奧西替尼一線治療EGFR突變陽(yáng)性的局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC，與標(biāo)準(zhǔn)治療相比（吉非替尼或厄洛替尼），可進(jìn)一步延長(zhǎng)患者的中位無進(jìn)展生存（median progression-free survival, mPFS）（18.9個(gè)月vs10.2個(gè)月），降低疾病進(jìn)展和死亡風(fēng)險(xiǎn)達(dá)54%（HR=0.46; 95%CI: 0.37-0.57;P＜0.000,1），給晚期肺癌患者帶來巨大的生存獲益。然而，第三代EGFR-TKIs應(yīng)用一段時(shí)間后不可避免地會(huì)出現(xiàn)耐藥，現(xiàn)就此問題進(jìn)行簡(jiǎn)單的綜述。

EGFR-TKIs的耐藥機(jī)制包括了固有耐藥和獲得性耐藥兩大類。固有耐藥目前原因不明，但解釋了敏感突變對(duì)各代EGFR-TKIs的客觀有效率并不能達(dá)到100%的原因。獲得性耐藥是腫瘤細(xì)胞在接觸藥物后通過各種變異規(guī)避藥物的影響，反映了腫瘤異質(zhì)性和腫瘤細(xì)胞的進(jìn)化，也是耐藥機(jī)制及耐藥對(duì)策研究的重點(diǎn)。根據(jù)是否依賴EGFR通路，第三代EGFR-TKIs的耐藥機(jī)制可以分為依賴EGFR和不依賴EGFR通路兩大類，前者包括新發(fā)突變、T790M減少或消失和EGFR基因擴(kuò)增等，后者包括旁路途徑的激活和細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變等，下文具體闡述。

1 依賴EGFR通路

1.1 新發(fā)EGFR突變EGFR-C797S突變是導(dǎo)致第三代TKI耐藥最常見的繼發(fā)突變。C797S是EGFR 20號(hào)外顯子797位點(diǎn)上絲氨酸取代了半胱氨酸的錯(cuò)義突變，位于EGFR的酪氨酸激酶區(qū)，C797S的突變使得奧西替尼（AZD9291）無法在ATP結(jié)合域內(nèi)繼續(xù)形成共價(jià)鍵，從而失去抑制EGFR激活的效果，導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。該突變最早發(fā)現(xiàn)于AZD9291治療的I期AURA試驗(yàn)患者的血漿游離DNA（cell-free plasma DNA, cfDNA）中（15例患者中有6例，40%）[4]。液滴數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，T790M突變患者AZD9291治療耐藥后會(huì)出現(xiàn)3種分子亞型，在檢測(cè)的15例患者中，6例新發(fā)C797S突變且仍存在EGFR敏感突變和T790M突變（40%），5例維持T790M突變但無C797S突變（33%），4例T790M突變消失也無C797S突變但仍存在EGFR敏感突變（27%）。隨后的研究發(fā)現(xiàn)[5]，C797S與T790M突變是否在同一等位基因具有重要的生物學(xué)意義，會(huì)影響后續(xù)TKIs的治療效果。EGFRC797S突變與T790M突變主要呈順式構(gòu)型（位于同一染色體上），占85%，對(duì)目前獲批的EGFR-TKIs單藥或聯(lián)合治療均耐藥。約10%患者為C797S/T790M反式構(gòu)型（位于不同染色體上），腫瘤細(xì)胞對(duì)第三代EGFR-TKIs耐藥，但對(duì)第一代和第三代TKIs聯(lián)合治療敏感。研究還發(fā)現(xiàn)小部分患者僅有C797S突變，未合并T790M突變，如果C797S在T790M野生型細(xì)胞中發(fā)生，則會(huì)導(dǎo)致第三代TKIs耐藥，而保留對(duì)第一代TKIs的敏感性。我國(guó)吳一龍教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了第一代和第三代EGFR-TKI聯(lián)合治療EGFRT790M和C797S反式突變有效的臨床病例，而且首次發(fā)現(xiàn)經(jīng)過厄洛替尼和奧西替尼聯(lián)合治療后EGFRT790M和C797S從反式向順式演變并介導(dǎo)耐藥，提示在靶向治療的每個(gè)階段進(jìn)行基因檢測(cè)是非常有必要的[6]。C797S突變?cè)趹?yīng)用不同第三代EGFR-TKIs發(fā)生率也有明顯差異，應(yīng)用奧西替尼發(fā)生率較高，約40%；應(yīng)用rociletinib發(fā)生率較低，約2%[7]。Sequist等[8]還報(bào)道9例rociletinib耐藥后改為奧西替尼治療的患者中，3例PR，4例SD，2例PD，中位PFS 208 d。其中6例rociletinib耐藥后直接進(jìn)行奧西替尼治療的患者均達(dá)到了PR或SD。3例rociletinib治療過程中CNS進(jìn)展的患者接受奧西替尼治療后CNS病灶控制良好。提示rociletinib耐藥可能是由于靶向抑制不完全，奧西替尼可逆轉(zhuǎn)這種耐藥，包括CNS進(jìn)展。C797S突變有時(shí)呈多克隆，常與其他靶向耐藥機(jī)制共存，這提示EGFR突變患者耐藥后的腫瘤呈異質(zhì)性，ctDNA的檢測(cè)可能會(huì)比組織活檢更能反映疾病的全貌[9]。

除了C797S，陸續(xù)有新的耐藥點(diǎn)突變被證實(shí)，如L798I、L692V、L718Q、E709K、G724S、G796R、G796D、G796S、L792F/H等[7,10-13]。體外實(shí)驗(yàn)[14]表明，EGFRL858R/T790M/C797S三突變的細(xì)胞對(duì)變構(gòu)抑制劑第四代TKI EAI045聯(lián)合西妥昔單抗敏感。EAI045單藥抑制作用弱，聯(lián)合西妥昔單抗在鼠肺癌模型中可使腫瘤緩解[15]。而體外和在體試驗(yàn)[16]均顯示，間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）抑制劑brigatinib聯(lián)合抗EGFR抗體對(duì)C797S/T790M/del19三突變的細(xì)胞敏感。這可能是3代TKIs耐藥后我們的研究方向。

1.2 T790M減少或消失 T790M突變減少或消失可能是第三代TKIs的選擇性壓力的結(jié)果，使T790M突變陰性克隆成為主導(dǎo)，也反映了腫瘤的異質(zhì)性。Thress等[4]報(bào)道的奧西替尼治療耐藥的15例患者中，4例出現(xiàn)T790M突變消失。Piotrowska等[17]報(bào)道的rociletinib治療后耐藥的12例患者中6例出現(xiàn)T790M突變消失，其中2例轉(zhuǎn)變?yōu)樾〖?xì)胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）。T790M的突變負(fù)荷可以預(yù)測(cè)第三代TKIs治療的效果，突變負(fù)荷越大，效果越好。相反，T790M消失的患者奧西替尼治療的效果更差[18]。

1.3EGFR基因擴(kuò)增EGFR基因擴(kuò)增更多見于rociletinib治療的患者，可以合并存在T790M突變。Piotrowska等[17]報(bào)道的rociletinib耐藥T790M突變存在的7例患者中，3例存在EGFR基因擴(kuò)增，Chabon等[7]報(bào)道rociletinib耐藥患者中有9%出現(xiàn)EGFR基因拷貝數(shù)的變化。細(xì)胞試驗(yàn)中，第三代TKI WZ4002耐藥的細(xì)胞株也可以觀察到EGFR基因擴(kuò)增[5]。EGFR基因擴(kuò)增可能會(huì)導(dǎo)致TKIs類藥物濃度相對(duì)不足，導(dǎo)致耐藥。

2 不依賴于EGFR通路

2.1MET和HER2擴(kuò)增MET和HER2擴(kuò)增作為重要的旁路激活途徑，在一代及三代TKI藥物耐藥機(jī)制中都具有重要地位。MET屬于肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體，具有酪氨酸激酶活性，參與細(xì)胞信息傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架重排的調(diào)控，是細(xì)胞增殖、分化和運(yùn)動(dòng)的重要因素。離體和在體實(shí)驗(yàn)[19]發(fā)現(xiàn)，MET與EGFR可以形成二聚體，此種二聚體依賴于EGFR的突變形式，在L858R+T790M中出現(xiàn)，加入MET抑制劑后能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Planchard等[20]最早報(bào)道了AZD9291耐藥的患者中存在MET和HER2擴(kuò)增，并伴T790M突變的消失。在第三代EGFR-TKI耐藥中，MET擴(kuò)增比較常見，rociletinib耐藥的患者中26%存在MET擴(kuò)增[7]，MET抑制劑克唑替尼單用或與三代TKIs聯(lián)和用藥可以很好地抑制三代TKIs耐藥腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在奧西替尼耐藥的患者中也可以檢測(cè)到MET擴(kuò)增，克唑替尼單藥治療有效[21]。Martinez-Marti等[22]在奧西替尼耐藥患者腦轉(zhuǎn)移病灶中也檢測(cè)到了MET擴(kuò)增，c-Met抑制劑capmatinib聯(lián)合ErbB-1/2/4抑制劑阿法替尼能完全抑制腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞原位注射小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。Planchard[20]及Oxnard等[23]對(duì)AZD9291耐藥患者的基因檢測(cè)分析中發(fā)現(xiàn)了HER2的擴(kuò)增。在rociletinib治療耐藥的患者中也觀察到類似的HER2的擴(kuò)增[7]。體外研究中[24]，曲妥珠單抗的藥物偶聯(lián)物T-DM1可以延緩或克服奧西替尼的耐藥。HER2和MET擴(kuò)增可以在應(yīng)用第三代EGFRTKI之前就存在，也可以在應(yīng)用第三代EGFR-TKI之后出現(xiàn)，伴或不伴T790M突變消失。應(yīng)用第三代EGFRTKI之前就存在MET擴(kuò)增的患者對(duì)第三代EGFR-TKI反應(yīng)更差[25]。

2.2PIK3CA基因突變 通過PI3K/AKT/mTOR途徑激活的PI3K脂質(zhì)激酶家族亞基PIK3CA是肺腺癌的致癌驅(qū)動(dòng)基因之一，常與HER2、MET及EGFR等其他突變合并存在，存在PIK3CA突變的肺癌患者中位生存時(shí)間更短[26,27]。Chabon等[7]報(bào)道了rociletinib耐藥患者的PIK3CA基因突變，發(fā)生率約12%。在AZD9291治療的患者中也有PIK3CA基因突變的報(bào)道[23]。

2.3 同源丟失性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tension homology deletechromosometen,PTEN）基因缺失PTEN是一個(gè)具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，通過抑制PI3K/Akt途徑的活化而抑制細(xì)胞增殖，與人類許多癌癥有關(guān)，也是第一代TKI耐藥的機(jī)制之一[28]。體外研究[29]發(fā)現(xiàn)，活化核糖核酸（RNAa）可以通過上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)而逆轉(zhuǎn)吉非替尼的耐藥。Kim等[30]報(bào)道一個(gè)EGFRT790M突變的病例，在奧西替尼治療前即存在PTEN缺失突變，奧西替尼治療后PTEN缺失的腫瘤比例和EGF mRNA水平增加，推測(cè)可能參與了局部的奧西替尼耐藥。

2.4 RAS-MAPK通路活化 對(duì)EGFR突變細(xì)胞系的耐藥機(jī)制臨床前研究顯示[31]，AZD9291獲得性耐藥與RAS信號(hào)通路激活有關(guān)，包括NRAS基因E63K突變，野生型NRAS及KRAS擴(kuò)增。在奧西替尼和rociletinib治療的患者中均發(fā)現(xiàn)了不同位點(diǎn)的KRAS活化突變，部分可與PIK3CA和MET等途徑共同存在[7,25]。Kim等[30]在奧西替尼治療的患者中檢測(cè)到了MAPK1基因的擴(kuò)增，而且研究[25,31]發(fā)現(xiàn)，MEK抑制劑如selumetinib和trametinib聯(lián)合第三代TKIs可以克服MAKP信號(hào)途徑的耐藥，目前I期臨床研究正在進(jìn)行。

2.5 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2-成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1（fibroblast growth factor 2-fibroblast growth factor receptor 1, FGF2-FGFR1） Kim等[30]報(bào)道了FGF2-FGFR1自分泌環(huán)介導(dǎo)的奧西替尼耐藥，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤有局灶性FGFR1基因擴(kuò)增和與基線相比20倍的FGF2 mRNA增長(zhǎng)，且伴有EGFRT790M突變的消失。

2.6 胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體（Insulin-like growth factor-1 receptor, IGF1R）通路 IGF1R主要通過下游PI3K/Akt信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、轉(zhuǎn)化和其他重要的生理過程，IGF1R導(dǎo)致EGFR-TKI繼發(fā)耐藥也主要是通過PI3K-AKT途徑實(shí)現(xiàn)的。臨床前研究顯示[32]，在wz4002耐藥的兩個(gè)細(xì)胞系中出現(xiàn)了IGF1R的異常激活伴胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-3的損失（IGFBP3），在體外實(shí)驗(yàn)和種植瘤模型中，抑制IGF1R活性的小分子或單克隆抗體的可以恢復(fù)wz4002敏感性，提示有可能應(yīng)用IGF1R抑制劑聯(lián)合EGFRTKIs治療來克服耐藥。

3 細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變

3.1 腫瘤細(xì)胞類型轉(zhuǎn)變 在第一代和第三代EGFR-TKIs治療后都能觀察到NSCLC的SCLC轉(zhuǎn)化，其在第一代EGFR-TKI的耐藥機(jī)制中占11%[33]。Lee等[34]研究發(fā)現(xiàn)，Rb1和p53基因失活的EGFR突變腺癌更易發(fā)生SCLC轉(zhuǎn)化。Piotrowska等[17]最先報(bào)道了2例SCLC轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的rociletinib耐藥，隨后Kim[30]及Ham等[35]報(bào)道了SCLC轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的奧西替尼耐藥。Ham等[35]報(bào)道的AZD9291 I期臨床研究的2例耐藥患者接受依托泊苷聯(lián)合卡鉑化療后腫瘤均明顯縮小，提示小細(xì)胞轉(zhuǎn)化可能為第三代EGFR-TKIs耐藥機(jī)制。我國(guó)也有類似的病例報(bào)道[36]。與第一代TKIs耐藥相似，腫瘤保持典型的EGFR驅(qū)動(dòng)突變，表明SCLC由EGFR突變克隆進(jìn)化而來，但T790M突變消失，抑癌基因RB1的基因組缺失或突變。AURA研究中奧西替尼治療進(jìn)展的22例患者中，除了檢測(cè)到2例SCLC外，還發(fā)現(xiàn)1例鱗癌轉(zhuǎn)化[18]。因此，對(duì)于TKIs耐藥的患者，除了液體活檢檢測(cè)相關(guān)突變基因之外，還需要同時(shí)強(qiáng)調(diào)組織活檢的重要性，來明確有無組織學(xué)類型的轉(zhuǎn)變[37]。

3.2 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT） Walter等[38]報(bào)道，CO1686獲得性耐藥與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及對(duì)AKT抑制劑的敏感性增加有關(guān)。Sakuma等[39]的體外研究發(fā)現(xiàn)，脯氨酰異構(gòu)酶Pin1能促進(jìn)EGFR突變型肺腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化。

4 其他

離體和在體研究均發(fā)現(xiàn)[40]，Src通路激活與EGFR野生型等位基因擴(kuò)增也會(huì)導(dǎo)致第三代TKIs的耐藥（rociletinib，奧西替尼）。BIM，也叫BCL-2蛋白11，是一種促凋亡分子，屬于bcl-2家族。目前研究認(rèn)為BIM蛋白缺失多態(tài)性同樣參與了第三代TKI s奧西替尼的耐藥，而組蛋白去乙?；?抑制劑可以通過上調(diào)BIM的表達(dá)來克服這種耐藥[41]。在奧西替尼耐藥患者的胸水細(xì)胞中，檢測(cè)到了BRAFV600E基因突變，BRAFV600E 抑制劑可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，聯(lián)合應(yīng)用奧西替尼效果更好[42]。

綜上，第三代EGFR-TKIs的耐藥機(jī)制與第一代類似，但是更為復(fù)雜，往往多種機(jī)制并存，rociletinib耐藥時(shí)46%患者存在一種以上的耐藥機(jī)制[7]。出現(xiàn)耐藥后需要更為準(zhǔn)確的血液、組織學(xué)檢測(cè)，尋找可能的耐藥機(jī)制，為臨床下一步治療提供線索。