萱花草總皂苷的微波提取及其抗腫瘤活性研究

劉立新 張雪松 張羽男 葉之慧 孫晶 于海濤 李晶 王晶 羅文澤 張強

摘要：以微波功率、提取時間和原料固液比為主要因素，采用L9（33）正交試驗進行微波輔助提取萱花草（H.emerocallisfulva）總皂苷工藝條件的優(yōu)化，所得最佳提取工藝條件為微波功率420 W、提取時間45 s、原料固液比1∶50（g∶mL）。采用SRB法研究萱花草總皂苷對人肝癌HepG2細胞的體外抗腫瘤活性，試驗結(jié)果表明萱花草總皂苷對人肝癌HepG2細胞株有良好的抗腫瘤活性，且優(yōu)于人參皂苷Rb1的陽性對照組。

關(guān)鍵詞：萱花草（H.emerocallisfulva）;總皂苷;微波輔助提取;抗腫瘤活性

中圖分類號：R284.2? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）21-0093-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.023? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Microwave Extracting and Antitumor Activity of

Total Saponins from H.emerocallisfulva

LIU Li-xina，ZHANG Xue-songb，ZHANG Yu-nana，YE Zhi-huic，SUN Jingb，

YU Hai-taob，LI Jingd，WANG Jingb，LUO Wen-zed，ZHANG Qiange

（a.School of Pharmacological Sciences;b.First Affiliated Hospital;c.Department of Stomatology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital;d.School of Basic Medical Sciences;e.School of Public Health，Jiamusi University，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China）

Abstract： Using microwave power， extracted time and solid-liquid ratio as main factors， the L9（33） orthogonal design was used for optimizing the extraction conditions of total saponins from H.emerocallisfulva. The optimum conditions were as：microwave power at 420 W，45 s of extracted time and solid-liquid ratio at 1∶50（g∶mL）. Antitumor activity of total saponins from H.emerocallisfulva was studied by the SRB assay，the result shows that total saponins from H.emerocallisfulva demonstrated good antitumor activity on human hepatoma HepG2 cells，and better than the ginsenosides Rb1.

Key words： H.emerocallisfulva; total saponins; microwave extraction; antitumor activity

目前，從自然植物中提取得到的天然抗腫瘤活性成分主要有黃酮類化合物、皂苷類化合物和多糖類化合物等，這些天然抗腫瘤活性成分在臨床治療中因具有療效確切和不良反應小等諸多優(yōu)點，成為當今抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點領(lǐng)域之一，特別是在抗腫瘤新藥及其先導化合物的發(fā)現(xiàn)中起著難以替代的作用[1-3]。但是，由于多數(shù)自然植物中的天然藥用活性成分含量低、提取工藝復雜且成本昂貴而難以形成規(guī)模效益，以至許多具有良好藥用前景的天然藥物活性成分無法開發(fā)成新藥而應用于臨床。

萱花草（H.emerocallisfulva）屬于百合科多年生宿根草本植物，原產(chǎn)于中國、西伯利亞、日本和東南亞等地[4]。萱花草在中國儲量豐富，一直以家畜飼料等低附加值形式被利用[5]。研究表明，萱花草中含有多種天然抗腫瘤藥用活性成分，如黃酮類、皂苷類和多糖類等天然藥用活性成分[6]。其中，皂苷（Saponin）作為一類苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的糖苷，具有抗菌、解熱、鎮(zhèn)靜及抗腫瘤等多種臨床藥用活性[7]。因此，從萱花草中提取總皂苷為獲得天然抗腫瘤活性成分提供了一個新的思路。然而，目前有關(guān)于萱花草中天然藥用活性成分的提取分離及抗腫瘤活性的研究還鮮見報道。

當前，從植物中提取皂苷的常規(guī)方法有溶劑提取法和色譜分離法等，其中溶劑提取法提取效率高但耗時較長且浪費溶劑，色譜分離法分離效果好但提取效率低難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求[8]。為改善上述方法，微波輔助提取法應運而生，由于其具有節(jié)能環(huán)保、萃取過程易于控制、高效省時和回收率高等優(yōu)點被廣泛用于植物天然藥物活性成分的提取[9]。因此，通過微波輔助提取法提取萱花草總皂苷為高效利用萱花草資源，獲取高附加值的天然藥用活性成分提供了科學依據(jù)。本研究采用微波輔助提取法提取萱花草總皂苷，以微波功率、提取時間和原料固液比為主要考察因素，采用L9（33）正交試驗對提取工藝進行了優(yōu)化，并對所提取產(chǎn)物進行了定性分析。同時，利用SRB法初步研究所提取產(chǎn)物對人肝癌HepG2細胞的體外抗腫瘤活性，以期為后期萱花草的資源利用和合理開發(fā)提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 萱花草來源于沭陽鑫三角園林綠化工程有限公司。人參皂苷標準品（色譜純）購于北京中科質(zhì)檢生物科技有限公司;DMEM（高糖）培養(yǎng)液購于上海西唐生物科技有限公司;胎牛血清購于上海勁馬實驗設備有限公司;冰醋酸、三氯甲烷、香草醛、五氯化銻、高氯酸等均為分析純。

1.1.2? 主要儀器? QIMO-J1-8型實驗室微波爐（琪摩科技有限公司）;FA2004電子天平（上海津平科學儀器有限公司）;UV-765PC紫外可見分光光度計（上?？茣钥茖W儀器有限公司）;Sigma2-16P實驗室臺式高速離心機（上海精學科學儀器有限公司）;Utrao-SM700酶標儀（上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司）;BPN-80CRW（UV）CO2培養(yǎng)箱（上海達平儀器有限公司）;YXQ-LS-100G型立式壓力蒸汽滅菌鍋（南京德旭儀器儀表有限公司）;xCELLigence RTCA S16細胞活力分析儀（昊諾斯科技有限公司）。

1.1.3? 細胞株? 人肝癌HepG2細胞由佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院提供。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 微波輔助法提取萱花草皂苷的單因素試驗

1）提取時間對皂苷提取率的影響。稱取原料20.0 g，在溫度為25 ℃，固液比為1∶50（2 g∶100 mL，下同），乙醇體積分數(shù)為70%的提取液條件下，分別設定時間30、45、60、75 s進行試驗。

2）微波功率對皂苷提取率的影響。稱取原料20.0 g，在溫度為25 ℃，固液比為1∶50，提取時間為45 s，乙醇體積分數(shù)為70%的提取液條件下，分別設定微波功率為70、140、280、420 W進行試驗。

3）原料固液比對皂苷提取率的影響。稱取原料20.0 g，在溫度為25 ℃，提取時間為45 s，乙醇體積分數(shù)為70%的提取液條件下，分別設定原料固液比為1∶25、1∶50、1∶75、1∶100進行試驗。

1.2.2? 提取工藝

1）萱花草總皂苷提取工藝。萱花草干草→粉碎機粉碎成粉→取9份各1.0 g，70%乙醇浸泡12 h→微波輔助提取→過濾→減壓濃縮→水浴揮干溶劑成干浸膏→去離子水溶解干浸膏→過濾→石油醚萃取→正丁醇萃取→水浴揮干溶劑成干浸膏→得到萱花草總皂苷粗品。

2）萱花草總皂苷精制。精密稱取10.0 mg萱花草總皂苷粗品置于燒杯中，用少量甲醇溶解后，定容在10 mL的容量瓶中，配制成1 mg/mL的提取液，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? 萱草總皂苷的的定性檢測? 泡沫鑒別法：將1.0 mL的待測提取液分別加入兩支具塞試管中，然后分別加入0.2 mL的NaOH溶液（5%）和0.2 mL的HCl溶液（5%），強烈振搖數(shù)分鐘，觀察現(xiàn)象，通過觀察得到的現(xiàn)象鑒別提取物中是否含有皂苷類化合物。

顯色反應法：采用氯仿-濃硫酸、醋酸酐-濃硫酸、香草醛-冰醋酸-高氯酸及五氯化銻氯顯色反應定性鑒別提取物中是否含有皂苷類化合物。

1.2.4? 總皂苷含量的測定

1）人參皂苷標準曲線的繪制。將人參皂苷干燥至恒重，精密稱取對照品5.0 mg，加甲醇溶解定容至5.0 mL，搖勻，作為對照品溶液。以Re（人參皂苷）的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線（λmax=545 nm），并進行線性回歸，得到回歸方程A=0.004 6C-0.063 8，R2=0.999 8，且人參皂苷標準曲線如圖1所示。

2）萱花草總皂苷含量的測定。精密吸取萱草總皂苷提取液2.0 mL于試管中，水浴加熱揮干溶劑并經(jīng)流水冷卻至室溫后，振搖溶解于0.2 mL的5%香草醛-冰醋酸溶液中，待溶解完全后加入0.8 mL高氯酸，搖勻后將其置于70 ℃的水浴中加熱15 min，至顯色完成后，經(jīng)流水冷卻至室溫。然后，再加入冰醋酸5.0 mL并充分振搖，靜置10 min后，在波長為545 nm處測定其吸光度。

1.2.5? 抗腫瘤活性

1）細胞培養(yǎng)。將細胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將生長期的細胞密度調(diào)至5×104個/mL，接種于96孔板，每孔180 μL，培養(yǎng)24 h[10]。

2）SRB（Sulforhodamine B）法。人肝癌HepG2細胞預培養(yǎng)24 h后，將溶于DMSO中的精制后的萱草總皂苷和人參皂苷Rb1加入96孔板，使兩種藥品的終濃度為12.5、25.0、50.0、100.0 mg/L，設3個復孔及對照孔。細胞加藥培養(yǎng)24 h，于培養(yǎng)板各孔中加入TCA（40%）每孔50 μL，然后在4 ℃下孵育1 h，棄去培養(yǎng)液，去離子水清洗風干。加入SRB溶液（0.4%，用1%乙酸稀釋），每孔100 μL。室溫靜置染色30 min，棄去SRB溶液，用1%乙酸洗4遍后風干。加入Tris-base堿液（10 mmol/L）每孔150 μL溶解，振蕩30 min，使用酶聯(lián)免疫檢測儀于492 nm測定吸光度OD492 nm。生物抑制率計算方法：

抑制率=×100%

3）SRB法統(tǒng)計分析。該抗腫瘤試驗平行3次，試驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準誤（X+Sx）表示。數(shù)據(jù)利用SPSS軟件（Windows version 20.0）分析處理。利用單因素分析法和One-Way ANOVA法對各組數(shù)據(jù)間的差異性進行分析比較。試驗設置的4組藥物濃度下的統(tǒng)計分析結(jié)果均為P<0.05（P<0.05時表示差異顯著）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 確定工藝

2.1.1? 微波輔助法提取萱花草總皂苷單因素試驗? 分析單因素試驗結(jié)果（圖2），最終確定試驗因素微波功率為420 W、提取時間為45 s，固液比為1∶50。

2.1.2? 微波輔助法提取工藝試驗及結(jié)果? 根據(jù)前期單因素試驗結(jié)果及文獻調(diào)研[5-9]，以微波功率、提取時間和原料固液比為主要因素，按照正交表L9（33）進行三因素三水平的正交試驗，正交試驗方案見表1。

正交試驗結(jié)果如表2所示，分析表中數(shù)據(jù)可知，采用微波輔助提取法提取萱花草總皂苷時，微波功率、提取時間和固液比3個考察因素的主次順序為B>A>C，即提取時間>微波功率>固液比，其最佳的提取工藝條件為A3B1C1，即微波功率為420 W、提取時間為45 s，固液比為1∶50，萱花草總皂苷的提取率為13.47%。

2.2? 提取物定性檢驗結(jié)果

2.2.1? 泡沫鑒別? 在相同試驗條件下，NaOH溶液（5%）和HCl溶液（5%）中均出現(xiàn)泡沫且高度相仿，表明萱花草提取液中可能含有皂苷類成分。

2.2.2? 氯仿-濃硫酸顯色反應? 取1.0 mL的提取液于試管（有塞）中待測，加入氯仿-濃硫酸溶液靜置分層，回收氯仿層，將濃硫酸層倒入蒸發(fā)皿后，于暗處顯現(xiàn)有綠色熒光，表明萱花草提取液中可能含有皂苷類成分。

2.2.3? 醋酸酐-濃硫酸顯色反應? 取適量待測提取物入具塞試管中，并用適量乙酸酐溶解完全，加入 1∶30體積比的濃硫酸-乙酸酐溶液后，溶液顏色依次出現(xiàn)黃、紅、紫及藍等的顏色變化，并最終退色，表明萱花草提取液中可能含有皂苷類成分。

2.2.4? 香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色反應? 取適量提取物于試管（有塞）中待測，加入香草醛-冰醋酸溶液（5%）并振搖溶解完全，隨后加入高氯酸，發(fā)現(xiàn)溶液顏色變?yōu)榧t棕色，表明萱花草提取液中可能含有皂苷類成分。

2.2.5? 五氯化銻顯色反應? 取適量待測提取物溶于乙醇中，用毛細玻璃管點于濾紙上，噴以五氯化銻氯仿液，60～70 ℃加熱，濾紙上的點最終顯藍色，表明萱花草提取液中可能含有皂苷類成分。

以上5種方法對提取物的定性檢驗結(jié)果證明萱花草提取物中含有皂苷類化合物。

2.3? SRB法檢測結(jié)果

采用SRB法對所提取產(chǎn)物和人參皂苷Rb1進行人肝癌HepG2細胞體外抗腫瘤活性對照試驗，結(jié)果見圖3。由圖3分析可知，所提取產(chǎn)物和人參皂苷Rb1在較低藥物濃度下即表現(xiàn)出抗腫瘤活性，且抗腫瘤活隨著藥物濃度的增加而增強;所提取產(chǎn)物對人肝癌HepG2細胞株表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，且優(yōu)于人參皂苷Rb1的陽性對照組。

3? 小結(jié)

利用正交試驗探究了微波輔助提取法提取萱花草總皂苷的最佳提取工藝條件為微波功率420 W、提取時間45 s和固液比1∶50。同時對所提取的萱花草總皂苷進行了初步的體外抗腫瘤活性研究，分析試驗結(jié)果表明，萱花草總皂苷對人肝癌HepG2細胞株的抑制作用優(yōu)于人參皂苷Rb1。本研究首次對儲量豐富且廉價易得的萱花草進行了天然抗腫瘤藥用活性成分的提取分離及抗腫瘤活性研究，為后續(xù)萱花草中天然抗腫瘤藥物活性成分的工業(yè)化開發(fā)及應用研究奠定基礎(chǔ)。

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