天冬酰胺酶納米微球體外活性和穩(wěn)定性

晏子俊， 李萬(wàn)玉， 胡雪原， 何 丹， 謝江川， 張景勍

（重慶醫(yī)科大學(xué) 藥物高校工程研究中心，重慶400016）

天冬酰胺酶（Asparaginase，AAS）是降解天冬酰胺的重要酶[1]。天冬酰胺是機(jī)體合成蛋白質(zhì)所需的重要氨基酸，某些腫瘤細(xì)胞（如白血病細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞等）的天冬酰胺合成酶活性非常低，不能合成天冬酰胺，須依賴宿主供給來(lái)合成所需蛋白質(zhì)[2]。AAS就是利用腫瘤細(xì)胞的這種機(jī)制，通過(guò)催化患者體內(nèi)的天冬酰胺的降解，抑制腫瘤細(xì)胞中所需蛋白質(zhì)的正常合成，從而使白血病細(xì)胞死亡[3-4]。但AAS存在穩(wěn)定性差、容易被酶降解、半衰期短和活性低等缺點(diǎn)[6-7]，限制了其在臨床上的應(yīng)用。

近來(lái)，文獻(xiàn)[8-11]報(bào)道的自組裝納米載體是一種新型的藥物載體。Ha等[10]采用自組裝的方法制備了載帶L-AAS的海藻酸-PEG/α-CD納米微球；Li等[11]采用自組裝方法制備了載帶葡萄糖氧化酶的羧甲基魔芋葡甘聚糖-PEG/α-CD納米微球。上述文獻(xiàn)報(bào)道的微球膜具有半滲透性和生物相似性，催化產(chǎn)物和酶的底物可順利通過(guò)微球膜，而被載帶的酶則不能自由通過(guò)，故拓寬了酶的最適溫度和最適pH，并提高了酶的穩(wěn)定性。

作者依據(jù)上述思路，制備了載帶AAS的自組裝透明質(zhì)酸-聚乙二醇 （Hyaluronic acid-graft-poly ethylene glycol，HA-g-PEG）/羥 丙 基 -β - 環(huán) 糊 精（Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin，HPCD）納米微球（self-assembly HA -g -PEG/HPCD hollow nanospheres loaded with AAS，AHHPs），并初步考察了AHHPs的體外活性和體外穩(wěn)定性，為臨床研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料、試劑 AAS：以色列Prospec公司，225 U/mg，純度≥ 96.0%；PEG：Sigma-aldrich公司，規(guī)格250 g；HA：曲阜市廣龍生物制品廠，純度＞99.0%；HPCD：成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司，純度＞98.0%；HA-g-PEG：作者所在實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)20140519、20140521、20140526；Tris-HCl 緩 沖 液 ：50 mmol/L、pH 7.3，作者所在實(shí)驗(yàn)室自配；其它試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器 Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器：上海司樂(lè)儀器有限公司；UV-7504 PC紫外分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；Zetasizer Nano zs90激光粒度電位儀：英國(guó)馬爾文公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 AHHPs的制備 采用文獻(xiàn)[8-11]報(bào)道的自組裝方法制備AHHPs。具體如下：將適量溶有AAS的HA-g-PEG溶液緩慢滴加至HPCD溶液中，開(kāi)始滴加時(shí)，溶液出現(xiàn)輕微的渾濁，即開(kāi)始有納米微球形成，繼續(xù)一定溫度下磁力攪拌2 h后，即得AHHPs，批號(hào)為 20140520、20140523、20140528。

1.2.2 AHHPs的透射電鏡 取 AHHPs適量，用Tris-HCl緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，用2%磷鉬酸染色后，滴于銅片上，在透射電鏡下觀察AHHPs的形態(tài)。

1.2.3 AHHPs粒徑和Zeta電位的測(cè)定 使用馬爾文粒度儀檢測(cè)AHHPs的粒徑和Zeta電位。取AHHPs適量，加入Tris-HCl緩沖液稀釋一定倍數(shù)后，測(cè)定AHHPs的粒徑和Zeta電位。

1.2.4 AHHPs包封率的測(cè)定 按照葡聚糖凝膠法[12]測(cè)定AHHPs的包封率。方法如下：制備過(guò)柱后的AHHPs，在595 nm波長(zhǎng)下，測(cè)得吸光度A1。同法處理，測(cè)得未過(guò)柱的AHHPs的吸光度A2。由測(cè)得的吸收值A(chǔ)1和A2計(jì)算出1 mL AHHPs混懸液中制劑所含AAS的量W1和AHHPs混懸液中AAS總量W2，包封率按照如下公式計(jì)算：

包封率=（W1/W2）×100%

式中，W1為AHHPs混懸液中制劑所含AAS的量，W2為AHHPs混懸液中AAS總量W2。

1.2.5 最適溫度和最適pH 將天冬酰胺溶于50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.3）中，分別在 20、30、40、50、60、70、80 ℃的水浴中預(yù)熱 10 min 后， 在 37 ℃下按照瑪斯本-利斯通法[13]測(cè)定AHHPs和游離AAS的活性，由測(cè)定結(jié)果得到溫度-活性曲線。在50mmol/L Tris-HCl緩沖液體系中分別配制 pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5 的天冬酰胺溶液，分別在37℃的水浴中預(yù)熱10 min后，測(cè)定AHHPs和游離AAS的活性，由測(cè)定結(jié)果得到pH-活性曲線。

1.2.6 熱穩(wěn)定性的測(cè)定 取適量AHHPs和游離AAS 溶液，放置于 55 ℃的水浴中[5]，分別于 0、1、2、3、4、5 h時(shí)取出，測(cè)定AHHPs和游離AAS的活性。

1.2.7 貯存穩(wěn)定性的測(cè)定 取適量AHHPs和游離AAS（AAS的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL）溶液，避光貯存于 4 ℃下，分別于 0、1、2、5、10、15、20、25、28 d 取出，測(cè)定AHHPs和游離AAS的活性。

1.2.8 酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定 取適量AHHPs和游離AAS（AAS的質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL）溶液，分別用pH 5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，8.0，9.5 的 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液稀釋3倍后，于37℃水浴中放置40 min后取出，測(cè)定AHHPs和游離AAS的活性。

1.2.9 抗胰蛋白酶水解能力的測(cè)定 取適量AHHPs和游離AAS（AAS的質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL）溶液，分別加入等體積的0.2 mg/mL胰蛋白酶溶液，混勻后置于 37 ℃水浴，分別于 0、10、20、30、40、50、60 min時(shí)取出，測(cè)定AHHPs和游離AAS的活性。

1.2.10 血漿穩(wěn)定性的測(cè)定 按照Saracino等[14]報(bào)道的方法配制體外模擬空白血漿。取適量AHHPs和游離AAS（AAS的質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL）溶液，分別與5倍體積的體外模擬空白血漿混勻，于37℃下孵育 0、1、2、4、8、12、24、48、72 h 后，測(cè)定 AHHPs和游離AAS的活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 AHHPs在透射電鏡下的形態(tài)

透射電鏡下觀察到AHHPs呈均勻分布的圓形或橢圓形，見(jiàn)圖1。

2.2 AHHPs的粒徑和Zeta電位

馬爾文激光粒度電位儀測(cè)得AHHPs的粒徑為（367.43±2.72）nm （見(jiàn)圖 2），Zeta 電位為 （-15.70±1.25）mV（見(jiàn)圖3）。說(shuō)明AHHPs分布均勻，符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖1AHHPs的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscopy image of AHHPs

圖2AHHPs的粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution of AHHPs

圖3 AHHPs的Zeta電位分布圖Fig.3 Zeta potential distribution of AHHPs

2.3 AHHPs的包封率

用excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過(guò)對(duì)3批AHHPs制劑的包封率進(jìn)行平行測(cè)定，結(jié)果得到AHHPs的包封率為（66.03±3.81）%。

2.4 最適溫度

AHHPs的最適溫度為50℃，游離AAS的最適溫度為60℃，見(jiàn)圖4。20～50℃時(shí)AHHPs和游離AAS的活性均隨溫度的升高而逐漸增加；60～80℃時(shí)AHHPs和游離AAS的活性則隨溫度的升高而逐漸降低；50～60℃時(shí) AHHPs的活性幾乎相等，且AHHNPs在20～80℃時(shí)的活性均大于游離AAS。

圖4 AHHPs和游離AAS的最適溫度（n=3）Fig.4 Optimal temperature of AHHPs and free AAS（n=3）

2.5 最適pH值

AHHPs的最適pH為7.0，游離AAS的最適pH為 7.5，見(jiàn)圖 5。由圖 5 可知，pH 5.5～7.0 時(shí)，AHHPs和游離AAS的活性均隨pH值升高而逐漸增加；pH 7.5時(shí)，游離AAS的活性雖進(jìn)一步增加，之后則開(kāi)始下降；pH 7.0～9.5時(shí)，AHHPs的活性雖在一直下降，但pH 7.0～8.0時(shí)，AHHPs的活性均大于游離AAS在最適pH 7.5時(shí)的活性，說(shuō)明AHHPs最適pH的范圍較游離 AAS有所變寬，且 pH 5.5～9.5時(shí)AHHPs的活性均大于游離AAS。

圖5 AHHPs和游離AAS的最適pH值（n=3）Fig.5 Optimal pH of AHHPs and free AAS（n=3）

2.6 熱穩(wěn)定性的測(cè)定

AHHPs和游離AAS的熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，5 h時(shí)AHHPs仍保留有55%以上的活性，而游離AAS在相同條件下的熱穩(wěn)定性較差；3 h時(shí)游離AAS已完全失活，說(shuō)明AHHPs的熱穩(wěn)定性明顯好于游離AAS。

2.7 貯存穩(wěn)定性的測(cè)定

AHHPs和游離AAS的貯存穩(wěn)定性測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，AHHPs在4℃保存28 d后，AHHPs的活性保留值仍為45%，而游離AAS的活性保留值則降為20%，且AHHPs在4℃指定保存時(shí)間點(diǎn)的活性均比游離AAS好，說(shuō)明AHHPs的貯存穩(wěn)定性比游離AAS好。

圖6 AHHPs和游離AAS的熱穩(wěn)定性（n=3）Fig.6 Thermal stabilities of AHHPs and free AAS（n=3）

圖7 4℃下AHHPs和游離AAS貯存穩(wěn)定性的測(cè)定（n=3）Fig.7 Storage stabilities ofAHHPsandfreeAAS incubated at 4 ℃（n=3）

2.8 酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定

AHHPs和游離AAS的酸堿穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知，pH 6.5～8.5時(shí)，AHHPs的活性保留值約為95%，游離AAS的活性保留最大值僅為85%，即pH 6.5～8.5時(shí)，AHHPs的活性均大于游離AAS在最大活性pH 7.5時(shí)的活性；pH 5.5～9.5時(shí)，AHHPs的活性均比同一pH值游離AAS的活性高，說(shuō)明HHNPs極大地提高了AAS抗外界環(huán)境酸堿變化能力。

圖8 AHHPs和游離AAS酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定（n=3）Fig.8 pH stabilities of AHHPs and free AAS（n=3）

2.9 抗胰蛋白酶水解能力的測(cè)定

AHHPs和游離AAS的抗胰蛋白酶水解能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖9。AHHPs在20 min時(shí)保留有80%左右的活性，60 min時(shí)其保留活性值仍為30%以上。相反，游離AAS的活性則呈快速下降的趨勢(shì)，20 min時(shí)已降到了60%左右，50 min時(shí)已全部失活。說(shuō)明AHHPs的抗胰蛋酶水解能力明顯強(qiáng)于游離AAS。

圖9AHHPs和游離AAS抗胰蛋白酶水解能力的測(cè)定（n=3）Fig.9 Proteolytic stabilities of AHHPs and free AAS（n=3）

2.10 血漿穩(wěn)定性的測(cè)定

AHHPs和游離AAS的血漿穩(wěn)定性測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)圖10。由圖10可知，8 h時(shí)AHHPs的活性保留值為80%以上，72 h時(shí)AHHPs的活性保留值約為20%；而游離AAS在8 h時(shí)的活性保留值約為40%，48 h時(shí)游離AAS已全部失活。AHHPs的最高活性點(diǎn)為2 h時(shí)，整個(gè)過(guò)程中其活性的變化趨勢(shì)是先降低再升高再降低；而游離AAS的最高活性點(diǎn)為0 h時(shí)，整個(gè)過(guò)程中其活性一直呈下降趨勢(shì)。說(shuō)明AHHNPs在模擬血漿中的穩(wěn)定性明顯比游離AAS好。

3 結(jié) 語(yǔ)

在最適溫度和最適pH實(shí)驗(yàn)中，AHHPs的最適溫度和最適pH均與游離AAS的不同，Ha等[12]制備的L-AAS納米微球和游離L-AAS也表現(xiàn)出不同的最適溫度與最適pH。相對(duì)于游離AAS，AHHPs的最適溫度和最適pH的改變及活性的增強(qiáng)可能是由于：1）AHHPs的制備過(guò)程中，自組裝納米微球包裹AAS的同時(shí)，AAS的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變；2）AAS與自組裝納米微球的膜通過(guò)某種方式相互作用穩(wěn)定了酶的活性[15]。一般情況下，pH及溫度過(guò)低或過(guò)高都可以影響到酶的穩(wěn)定性，從而使其發(fā)生不可逆的破壞，溫度、pH與酶發(fā)揮最大活性密切相關(guān)，酶在其最適溫度和最適pH時(shí)，其活性最高，酶促反應(yīng)速度也最快，而小于或大于這個(gè)范圍，其活性都會(huì)有所降低。

圖10 AHHPs和游離AAS血漿穩(wěn)定性的測(cè)定（n=3）Fig.10 Plasma stability of AHHPs and free AAS（n=3）

AHHPs的熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、抗胰蛋白酶水解能力和血漿穩(wěn)定性均明顯好于AAS，原因可能是酶蛋白中的一些高級(jí)結(jié)構(gòu)或蛋白質(zhì)中的反應(yīng)基團(tuán)裸露于外部環(huán)境中，過(guò)低或過(guò)高的溫度、過(guò)堿或過(guò)酸的環(huán)境、貯存的時(shí)間、酶的水解及血漿的存在均使得酶分子的性質(zhì)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)有所改變，而導(dǎo)致酶活力的改變甚至喪失。

本研究得到的自組裝HA-g-PEG/HPCD納米微球是一種新型的藥物載體，將AAS制備成AHHPs后，減少了外界環(huán)境變化對(duì)酶分子構(gòu)象的影響，并對(duì)酶蛋白具有一定的保護(hù)作用，因而使得AAS的穩(wěn)定性獲得了提高。

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