牛血清蛋白磁性殼聚糖微球谷氨酸改性吸附

萬(wàn) 威， 李林強(qiáng)， 王瑞琴

（陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710119）

我國(guó)的動(dòng)物血資源極其豐富，每年約在2.3×106t以上，除少部分提取物得到利用外，大部分被廢棄掉，既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境[1-2]。牛血清蛋白（BSA）是牛血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，具有許多重要的生理功能，常用于生物、醫(yī)藥和保健食品等領(lǐng)域，對(duì)其進(jìn)行快速高效的分離純化廣受關(guān)注[3-4]。磁性微球分離、富集BSA是一種新興技術(shù)，其易操作、效率高、成本低、易再生等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。殼聚糖是甲殼素脫乙酰基產(chǎn)物，作為堿性多糖其羥基、氨基含量豐富，易于通過(guò)化學(xué)修飾賦予多種功能[7]，由殼聚糖包覆磁性粒子制成的磁性殼聚糖微球兼有殼聚糖無(wú)毒與生物相容性好的特點(diǎn)[8]，但其對(duì)BSA吸附量較小，需對(duì)其進(jìn)行改性以提高其吸附效果。通過(guò)在微球上連接羧基使其表面帶負(fù)電荷，以提高其吸附能力，一直是研究的熱點(diǎn)之一[9-14]。L-谷氨酸具有安全無(wú)害、廉價(jià)易得、不造成污染等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，其所含氨基基團(tuán)能夠在弱堿條件下通過(guò)環(huán)氧氯丙烷與殼聚糖上的-NH2、-OH以共價(jià)鍵的方式結(jié)合，同時(shí)引入兩分子的羧基基團(tuán)。

作者采用反相懸浮法制備磁性殼聚糖微球，并通過(guò)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)谷氨酸與磁性殼聚糖微球，探討溶液pH值、BSA質(zhì)量濃度、吸附時(shí)間等因素對(duì)BSA吸附效果的影響，并考察微球的可重用性，以期對(duì)磁性分離技術(shù)用于牛血清蛋白的分離回收提供一種便捷的新途徑。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

殼聚糖（脫乙酰率≥90.0%）、L-谷氨酸：購(gòu)于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；牛血清蛋白：購(gòu)于美國(guó)Amresco公司；Span-80、液體石蠟：化學(xué)純；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡：FEI公司；Tensor27紅外光譜儀：德國(guó)Bruker公司；MS2000激光粒度分析儀：英國(guó)馬爾文儀器公司；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；雷磁PHS-3C酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器公司；D2F-6020型真空干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 磁性殼聚糖微球的合成及谷氨酸改性 根據(jù)文獻(xiàn)[15]制備殼聚糖包覆Fe3O4磁性微球的方法并加以改進(jìn)，采用反相懸浮法制備磁性殼聚糖微球[16-17]，并連接谷氨酸[18-19]。用3%的鹽酸配置60 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%殼聚糖溶液，加入100 mL FeCl3溶液（0.15 mol/L）超聲使其徹底混合均勻，在機(jī)械攪拌下加入 30 mL NaHSO3（0.1 mol/L）溶液，當(dāng)溶液由黃色變?yōu)榧t色再次變成黃色的瞬間用12%的氨水調(diào)節(jié)pH至11，70℃劇烈攪拌2 h后磁鐵吸附收集，用去離子水洗滌多次后加入3%的鹽酸使其再次溶解，得到磁性殼聚糖鹽酸溶液。

在40℃恒溫水浴條件下，加入200 mL液體石蠟和8 mL Span-80于500 mL燒瓶，機(jī)械攪拌混勻后，加入40 mL磁性殼聚糖鹽酸溶液，劇烈攪拌1 h，加入5 mL 25%戊二醛繼續(xù)攪拌1 h。將0.4 g谷氨酸、2 mL環(huán)氧氯丙烷、適量DMF和5 mL Na2CO3（0.5 mol/L）溶液于40℃攪拌活化1 h后滴加到燒瓶中。60℃劇烈攪拌3 h，產(chǎn)物用去離子水、無(wú)水乙醇、石油醚、丙酮反復(fù)多次沖洗，用磁鐵吸附分離于60℃真空干燥24 h。使用紅外光譜儀（IR）檢測(cè)殼聚糖包覆Fe3O4效果、殼聚糖與谷氨酸的連接效果；使用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察GA-CMNs形貌；使用激光粒度儀檢測(cè)GA-CMNs的粒徑分布情況。

1.3.2 GA-CMNs對(duì)BSA的吸附容量 準(zhǔn)確稱(chēng)量0.010 g GA-CMNs加入一定質(zhì)量濃度的BSA溶液，25℃恒溫水浴振蕩（120 r/min）一段時(shí)間。通過(guò)磁鐵吸附分離磁性微球，測(cè)定上清液在UV278 nm[13]吸光度值，并利用測(cè)定吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算BSA的初始和最終質(zhì)量濃度，利用下式計(jì)算吸附容量：

式中，c0為初始BSA質(zhì)量濃度 （mg/mL）；c1為吸附后BSA質(zhì)量濃度 （mg/mL）；V為溶液的體積，mL；m為 GA-CMNs的質(zhì)量（g）；Qe為吸附容量（mg/g）。

1.3.3 不同pH值溶液對(duì)BSA吸附量的影響 稱(chēng)取10 mg的GA-CMNs，加入到4 mL pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 質(zhì) 量 濃 度 為 1 mg/mL 的BSA溶液中，25℃恒溫水浴振蕩100 min后分離，測(cè)定并計(jì)算吸附量，采用0.05 mol/L CH3COONa-CH3COOH緩沖液控制pH 4.0～6.0；采用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液控制 pH 7.0～9.0。

1.3.4 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)BSA吸附量的影響 配置BSA質(zhì)量濃度為1 mg/mL，稱(chēng)取10 mg的GA-CMNs加入到4 mL含不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)（分別為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的 NaCl溶液）的 BSA溶液中，其余操作同上，測(cè)量并計(jì)算吸附量。

1.3.5 吸附時(shí)間對(duì)BSA吸附量的影響 稱(chēng)取50 mg GA-CMNs，加入20 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL BSA溶液中，120 min內(nèi)每10分鐘取上清液測(cè)定并計(jì)算吸附量。

1.3.6 初始BSA質(zhì)量濃度對(duì)BSA吸附量的影響稱(chēng)取10 mg GA-CMNs，加入4 mL質(zhì)量濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/mL 的 BSA 溶液中，pH值設(shè)置為5.0，吸附時(shí)間為100 min，測(cè)定并計(jì)算吸附量。

1.3.7 GA-CMNs的再生 取10 mg GA-CMNs將其飽和吸附BSA后，分離后用選取的NaCl溶液在室溫條件下于120 r/min振蕩30 min后，磁鐵吸附分離，取上清液在UV278 nm測(cè)定并用下式計(jì)算洗脫率：

洗脫率（%）=cV2/（c0-ce）V1×100%

式中c為洗脫液中 BSA的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V2為洗脫液的體積 （mL）；c0為初始BSA質(zhì)量濃度（mg/mL）；ce為吸附后溶液中 BSA的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V1表示加入的 BSA的體積（mL）。

2 結(jié)果與討論

2.1 GA-CMNs的表征

圖1解析結(jié)果表明，殼聚糖（a）中3 455 cm是O-H和N-H的伸縮振動(dòng)峰，2 923 cm-1和2 853 cm-1的強(qiáng)峰屬于CH伸縮聚合物骨架的振動(dòng)，而在約1 073 cm-1和1 487 cm-1分別是C-O和殼聚糖環(huán)貢獻(xiàn)的伸縮振動(dòng)峰。殼聚糖改性微球（b）中588 cm-1峰，屬于Fe-O伸縮振動(dòng)。a中的1 644 cm屬于伯胺（-NH2）的變形振動(dòng)，在b中消失，出現(xiàn)1 618 cm-1仲胺的振動(dòng)吸收峰；此外在b中可以觀察到在1 402 cm-1來(lái)自R-CH2-COOH的CH伸縮振動(dòng)和1 718 cm-1飽和C=O的伸展吸收峰，并且位于3 650～3 200 cm-1O-H伸縮的吸收峰變寬，進(jìn)一步說(shuō)明分子中存在羧基。由此紅外光譜圖可以說(shuō)明谷氨酸成功交聯(lián)到磁性殼聚糖微球上。

圖1 殼聚糖和谷氨酸改性殼聚糖微球的紅外光譜Fig.1 FT-IR spectrum of chitosan and GA-CMNs

由圖2（a）可見(jiàn)，在掃描電子顯微鏡下可見(jiàn)GACMNs為類(lèi)球形結(jié)晶，表面較光滑且形狀規(guī)則，粒徑為 5～20 μm；由激光粒度儀測(cè)的數(shù)據(jù)圖 2（b）可見(jiàn)，顯示有40%的微球粒徑小于20 μm，已達(dá)到微米級(jí)。

圖2GA-CMNs的形貌圖(a)和GA-CMNS的粒度分布圖(b)Fig.2 MicroscopicmorphologyofGA-CMNsand particle size distribution of GA-CMNs

2.2 BSA溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.200 g BSA，用pH 5.0的緩沖溶液溶解，配制成2 mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，再稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描，得到最大吸收波長(zhǎng)為 278 nm，與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在 0～2.0 mg/mL范圍內(nèi)其吸光度A與質(zhì)量濃度c線性關(guān)系良好，擬合方程為A=0.613 8c+0.012 1，R2=0.999 2。

2.3 溶液pH值對(duì)BSA吸附量的影響

由圖3可見(jiàn)，未改性微球?qū)SA吸附量隨著pH值的改變化不大，而GA-CMNs對(duì)BSA最大吸附量出現(xiàn)在pH 5.0，接近BSA等電點(diǎn)[20]。因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)時(shí)，BSA呈電中性，BSA分子間斥力最小[21]；pH在5.0以上，GA-CMNs上羧基以COO-形式存在，pH低于 5.0，GA-CMNs和牛血清蛋白的胺基為NH3+，不利于氫鍵的形成[22]。因此，在 pH 5.0 時(shí)，GACMNs對(duì)BSA的吸附量達(dá)到最大值。

圖3 pH對(duì)吸附效果的影響Fig.3 Influence of pH on adsorption of BSA

2.4 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)BSA吸附量的影響

由圖4可見(jiàn)，GA-CMNs對(duì)BSA的吸附量隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加逐漸減小。當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到0.5%，BSA的吸附量下降約20%；當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到1%，吸附量下降約50%，表明BSA吸附量受NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響顯著?？赡苡捎贜aCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，溶液離子氛圍增強(qiáng)使得蛋白質(zhì)分子間靜電斥力增大，導(dǎo)致遷移速度減慢；并且吸附劑結(jié)合空間位阻與靜電斥力的增加，影響B(tài)SA分子構(gòu)象，破壞了GA-CMNs與BSA分子間的靜電作用，僅靠范德華力與BSA分子結(jié)合，導(dǎo)致吸附效果明顯下降[22]。

用Lagergren一級(jí)吸附速率方程和二級(jí)吸附速率方程[23]進(jìn)行擬合分析，擬合所得方程分別為y=-0.033 5x+2.005 9和y=0.011x+0.065 7，決定系數(shù)（R2）分別為0.958 2和0.994 1說(shuō)明準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型更能反映GA-CMNs對(duì)BSA的吸附過(guò)程。

圖4 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)吸附效果的影響Fig.4 Influence of ionic strength on the adsorption of BSA

2.5 吸附時(shí)間對(duì)BSA吸附量的影響

由圖5可見(jiàn)，在前30分鐘內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，GA-CMNs對(duì)BSA的吸附量顯著增大（p＜0.05）。而40 min之后吸附量無(wú)顯著變化（p＞0.05），表明在40 min左右達(dá)到吸附平衡。結(jié)果表明，GA-CMNs表面結(jié)合點(diǎn)在經(jīng)過(guò)一段時(shí)間吸附占用后，剩余吸附結(jié)合位點(diǎn)較難被利用，表明其對(duì)BSA的吸附可能是單層覆蓋。

圖5 吸附時(shí)間對(duì)BSA吸附量的影響Fig.5 Influence of adsorption time on the adsorption of BSA

2.6 不同BSA質(zhì)量濃度對(duì)吸附量的影響

由圖6可見(jiàn)，GA-CMNs對(duì)BSA的吸附量隨著B(niǎo)SA溶液質(zhì)量濃度的增大顯著增加（p＜0.05），最大平衡吸附量出現(xiàn)在BSA質(zhì)量濃度為1 mg/mL附近，再增大BSA的質(zhì)量濃度，吸附量變化不大，最大吸附量為83.5 mg/g。

用 Langmuir方程和Freudlich方程[24]進(jìn)行擬合分析，所得決定系數(shù)（R2）分別為0.997 7和0.975，結(jié)果表明單層吸附為主的Langmui模型擬合方程的決定系數(shù)比Freundlich模型擬合方程的決定系數(shù)高，表明GA-CMNs對(duì)BSA的吸附以單分子層為主。

圖6 BSA初始質(zhì)量濃度對(duì)吸附量的影響Fig.6 Influence of initial concentration of BSA on its adsorption

2.7 GA-CMNs的再生

當(dāng)溶液NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，GA-CMNs對(duì)BSA的吸附量下降了約80%，而繼續(xù)加大NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)，吸附量下降不明顯，故選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的NaCl溶液作為洗脫劑。經(jīng)過(guò)5次吸附-洗脫循環(huán)，洗脫率仍大于90%，重復(fù)吸附量基本不變，表明GA-CMNs具有很好的重復(fù)使用性。

3 結(jié)語(yǔ)

以廉價(jià)易得的試劑為原料[9-10]在溫和的條件[11-14]合成谷氨酸改性磁性殼聚糖微球。并以BSA為目標(biāo)蛋白質(zhì)，研究了GA-CMNs對(duì)BSA的吸附情況，考察pH值、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、時(shí)間、BSA初始質(zhì)量濃度等條件對(duì)其吸附效果的影響，并對(duì)GA-CMNs的再生進(jìn)行了研究。

紅外圖譜分析結(jié)果表明，谷氨酸成功地交聯(lián)在磁性殼聚糖微球的表面。掃描電子顯微鏡下觀察到GA-CMNs為表面較光滑、形狀規(guī)則的類(lèi)球形結(jié)晶，粒徑為5～20 μm，由激光粒度儀檢測(cè)結(jié)果顯示，粒徑小于20 μm占總體積的40%左右。在25℃時(shí)GA-CMNs對(duì)BSA最佳吸附條件：pH值為5，BSA質(zhì)量濃度為1 mg/mL，飽和吸附時(shí)間為40 min，吸附量為83.5 mg/g左右。其對(duì)BSA吸附平衡過(guò)程符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程和Langmuir吸附等溫線模型。

用3%的NaCl溶液作為洗脫劑，洗脫率為97.2%，經(jīng)過(guò)5次吸附-洗脫循環(huán)，洗脫率均大于90%，重復(fù)吸附量基本不變，表明GA-CMN吸附洗脫性能良好。該方法制備過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低廉、洗脫率高，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步研究動(dòng)物血液中血清蛋白回收等方面的應(yīng)用提供參考。

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