延寄參膠囊中生物堿類化學(xué)成分的超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法研究*

陳衍斌，何 娟，盧新義 ，馬久太，孫宇宏,孫寶平,劉 峰1,△

1.陜西國際商貿(mào)學(xué)院 (咸陽 712000)，2.陜西步長制藥有限公司(西安 710075)

延寄參膠囊是由延胡索、北劉寄奴、人參、骨碎補(bǔ)四味中藥組成的復(fù)方制劑，現(xiàn)代藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)延寄參膠囊對犬冠脈血流量及冠脈阻力具有較大影響，相對于對照藥地爾硫卓，延寄參膠囊能夠有效地增加犬動脈流量，降低冠脈阻力；在對大鼠心肌缺血模型的研究中，延寄參膠囊能夠降低缺血后再灌注引起的心律失常及心肌內(nèi)丙二醛(MDA)含量，同時能夠提升超氧化物歧化酶(SOD)活性；在對兔血小板聚集的影響研究中發(fā)現(xiàn)，與阿司匹林比較，該藥物能夠明顯延長血栓形成時間[1]。延寄參膠囊可以從多方面對動脈粥樣硬化所引起的病理損傷進(jìn)行修復(fù)，緩解所引發(fā)的心臟不適癥狀，然而延寄參膠囊的化學(xué)成分及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，對其化學(xué)成分的研究工作十分重要。本文采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF-MS)對延寄參膠囊中生物堿類化學(xué)成分進(jìn)行分析。UPLC-Q-TOF-MS是一種將色譜的高效在線分離與質(zhì)譜的高靈敏度、高分辨率完美結(jié)合的聯(lián)用技術(shù)，能夠準(zhǔn)確快速地對中藥復(fù)雜體系中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。目前，對延寄參膠囊中生物堿類化學(xué)成分的研究基本采用分離、提純、鑒定的方法，很少采用LC/MS分析法。本研究首次采用UPLC-Q-TOF-MS法在正離子模式下對延寄參膠囊中的生物堿類化學(xué)成分進(jìn)行了定性研究，旨在為延寄參膠囊中生物堿類化學(xué)成分快速準(zhǔn)確的分析提供方法，并為其止痛藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

儀器與試藥

1 儀 器 H-Class型超高效液相色譜儀、G2-XS QTOF型質(zhì)譜儀、Masslynx 4.1工作站(美國Waters公司)；DV215CD型電子天平(德國梅特勒公司)；KUDOS型超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；TDL-5A型低速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；優(yōu)普超純水機(jī)(成都超純科技有限公司)。

2 試 藥 延寄參膠囊(批號1607121、1607122、1607131)；色譜純甲酸(Sigma公司)；色譜甲醇、乙腈(美國Fisher公司)；水為脫氣高純水。

方 法

1 供試品溶液制備 稱取延寄參膠囊內(nèi)容物0.5g，于50ml的錐形瓶內(nèi)，加入25ml色譜甲醇，超聲30min后，將混懸液離心15min(5000r/min)，上清液用色譜甲醇稀釋100倍后，用0.22μm的微孔濾膜過濾后備用。

2 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7μm)；流速為0.4 ml/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣體積為2μl；流動相為0.1%甲酸溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

3 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；毛細(xì)管電壓：1.0 kV；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：800L/h；霧化氣壓力：35psi；碎裂電壓：135V；正離子模式下掃描檢測，一級質(zhì)譜掃描范圍：100-1000 m/z，二級質(zhì)譜掃描范圍：50-1000 m/z；參比離子設(shè)置為m/z 556.2771。

4 數(shù)據(jù)分析 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用MassLynx 4.1軟件進(jìn)行峰提取，UNIFI軟件進(jìn)行峰識別，結(jié)合Massbank數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)報道進(jìn)行確證。

結(jié) 果

本研究在正離子模式下共定性鑒別出9種生物堿類化合物，按照保留時間的先后順序依次為四氫非洲防己堿、原阿片堿、延胡索乙素、小檗堿、海罌粟堿、黃連堿、延胡索甲素、非洲防己堿、氫化小檗堿。延寄參膠囊樣品溶液在正離子模式下的總離子流圖見圖1，總離子流圖中3-8min局部放大圖見圖2，各化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)詳見表2。

圖1 延寄參膠囊(批號1607121、1607122、1607131)醇提物總離子流圖(正離子模式)

圖2 延寄參膠囊(1607121)醇提物總離子流圖3～8min(正離子模式)

表2 延寄參膠囊(1607121)醇提物在正離子模式下的UPLC-Q-TOF-MS分析結(jié)果

本次研究檢出的生物堿類化合物按照結(jié)構(gòu)可以分為季胺類生物堿、叔胺類生物堿、原阿片堿類、阿樸菲類。以上各類化合物的裂解過程解析如下：

1 季胺類生物堿 化合物9的保留時間為6.91min，分子離子峰m/z338.1378為 [M+H]+。在二級質(zhì)譜中，特征碎片離子m/z323.0125為 [M+H-CH3]+，m/z322.0045為 [M+H -CH3-H]+，特征碎片離子m/z 294.0321為 [M+H -CH3-H-CO]+。結(jié)合文獻(xiàn)[2]報道，推測該化合物為非洲防己堿。同理推測化合物4為小檗堿[3]。化合物6的保留時間為5.84min，分子離子峰m/z320.0912為 [M+H]+。在二級質(zhì)譜中，特征碎片離子m/z292.0715為[M+H-CO]+，結(jié)合文獻(xiàn)[4]報道，推測化合物6為黃連堿。這三個化合物都屬于季胺類生物堿，結(jié)構(gòu)中的吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)無法發(fā)生RDA 裂解，主要通過取代基的碎裂形成碎片離子。在正離子模式下均產(chǎn)生[M+H]+的分子離子峰，二級質(zhì)譜中鄰二甲氧基先失去1分子甲基后再失去1 個氫從而形成亞甲二氧基，亞甲二氧基會繼續(xù)丟失1分子一氧化碳從而形成1 個穩(wěn)定的三元氧環(huán)。黃連堿的結(jié)構(gòu)中無甲氧基取代，所以其裂解途徑為直接丟失C=O。

季胺類生物堿以小檗堿為例圖示其裂解途徑及二級質(zhì)譜圖，見圖3。

圖3 化合物4(小檗堿)的二級質(zhì)譜圖、分子結(jié)構(gòu)及裂解途徑

2 叔胺類生物堿 化合物3的保留時間是5.32min，分子離子峰m/z356.1851為 [M+H]+。在二級質(zhì)譜中，特征碎片離子m/z341.1622為母離子失去一個取代基CH3而形成，即[M+H-CH3]+；m/z324.1532為母離子失去一個取代基CH3OH而形成，即[M+H-CH3OH]+；此外，母離子還會發(fā)生RDA裂解，產(chǎn)生m/z192.0902、165.0803的互補(bǔ)碎片離子，結(jié)構(gòu)中的四氫異喹啉部分為含氮碎片離子，苯環(huán)部分為互補(bǔ)碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)[5]報道，推測化合物3為延胡索乙素。同理可推測化合物1為四氫非洲防己堿[6]，化合物8為延胡索甲素[5]，化合物10為氫化小檗堿[7]。四氫非洲防己堿、延胡索乙素、延胡索甲素、氫化小檗堿均屬于叔胺類生物堿，結(jié)構(gòu)相似，在正離子模式下以[M+H]+分子離子峰形式存在，在二級質(zhì)譜中會出現(xiàn)RDA裂解形成互補(bǔ)的碎片離子。

叔胺類生物堿以延胡索乙素為例圖示其裂解途徑及二級質(zhì)譜圖，見圖4。

圖4 化合物3(延胡索乙素)的二級質(zhì)譜圖、分子結(jié)構(gòu)及裂解途徑

3 原阿片堿類 化合物2的保留時間是5.14min，分子離子峰m/z354.1336為 [M+H]+。在二級質(zhì)譜中出現(xiàn)的m/z206.0055和m/z149.0122兩個碎片離子為母離子發(fā)生RDA裂解所產(chǎn)生，結(jié)合文獻(xiàn)[8]報道，推測該化合物為原阿片堿。其裂解途徑及二級質(zhì)譜圖見圖5。

圖5 化合物2(原阿片堿)的二級質(zhì)譜圖、分子結(jié)構(gòu)及裂解途徑

4 阿樸菲類 化合物5的保留時間是5.74min，分子離子峰m/z 356.1849為 [M+H]+。在二級質(zhì)譜中出現(xiàn)的m/z 325.1418 碎片離子為分子離子丟失1分子甲氧基形成；碎片離子m/z 310.1178為分子離子丟失1分子甲氧基和1分子甲基所形成；碎片離子m/z 294.1231為分子離子丟失2分子甲基形成；碎片離子m/z 279.1002為分子離子失去2分子甲氧基和1分子甲基所形成。結(jié)合文獻(xiàn)[9]報道，推測化合物5為海罌粟堿。其裂解途徑及二級質(zhì)譜圖見圖6。

圖6 化合物5(海罌粟堿)的二級質(zhì)譜圖、分子結(jié)構(gòu)及裂解途徑

討 論

延寄參膠囊是一個由延胡索、人參、骨碎補(bǔ)、北劉寄奴四味中藥材組成的中藥復(fù)方制劑，化學(xué)成分體系較為復(fù)雜[10]。君藥延胡索入心肝脾經(jīng)，具有活血行氣止痛的功效，其所含的生物堿類化學(xué)成分具有較強(qiáng)的生物活性，是延寄參膠囊的主要藥效成分。通過上述研究共定性鑒別出9種生物堿類化學(xué)成分，分別是四氫非洲防己堿、原阿片堿、延胡索乙素、小檗堿、海罌粟堿、黃連堿、延胡索甲素、非洲防己堿、氫化小檗堿。本文首次采用高靈敏度、高分辨率的超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)在同一條件下快速分析了延寄參膠囊中的生物堿類化學(xué)成分，為延寄參膠囊中生物堿類化學(xué)成分的快速鑒定提供了方法，同時也為闡明延寄參膠囊止痛類功效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了可靠依據(jù)。

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