參芪止皰顆粒抗HSV-2的體外實(shí)驗(yàn)研究*

候亞林，杜立行，歐柏生，孫亞如，黃 濤，黃 彥，王 藝

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)(南寧 530001)，2. 南寧市第十人民醫(yī)院(南寧 530105)，3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科(南寧 530023)

生殖器單純皰疹病毒(Herpes simplex viruses type 2，HSV-2) 主要通過性接觸傳播感染人類，引起人類生殖器皰疹(Genital herpes，GH)。HSV-2陽性患者易合并梅毒蒼白螺旋體感染，且易并發(fā)各種泌尿生殖系統(tǒng)感染，增加了疾病的治療難度，給性傳播疾病的預(yù)防和控制帶來一定的負(fù)面影響[1]。目前認(rèn)為，生殖器皰疹是一種尚不能徹底根治的病毒感染性性病。西醫(yī)治療本病的主要藥物有阿昔洛韋和法昔洛韋等抗病毒藥，這些藥物雖對減輕發(fā)作癥狀、減少病毒排放、縮短病程有一定作用，但都難以達(dá)到徹底根治的目的，且存在耐藥問題[2-3 ]。參芪止皰顆粒是歐柏生教授用于治療生殖器皰疹的一個(gè)有效方劑，臨床研究[4]證實(shí)其在抗生殖器皰疹復(fù)發(fā)方面具有療效，且能提高機(jī)體免疫力。為進(jìn)一步探討參芪止皰顆粒抗HSV-2的作用機(jī)制，我們進(jìn)行了相關(guān)的體外實(shí)驗(yàn)。

材料與方法

1 材 料

1.1 細(xì)胞:經(jīng)培養(yǎng)、分離、鑒定無污染的人包皮成纖維細(xì)胞(Human foreskin fibroblast，HFF)，HFF常規(guī)培養(yǎng)傳代,以上均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院伍參榮教授實(shí)驗(yàn)組完成。

1.2 病毒：HSV-2，由廣州博特生物技術(shù)公司提供。HSV-2經(jīng)HFF活化增殖，收獲病毒作為毒種。

1.3 藥物：參芪止皰顆粒(藥物組成：太子參、知母、黃柏各12g，黃芪、白花蛇舌草、大青葉、板藍(lán)根、魚腥草、絲瓜絡(luò)、薏苡仁各30g，柴胡8g，甘草3g)，采用培力(南寧)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的農(nóng)本方免煎配方顆粒劑,由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房提供，用無菌蒸餾水溶解成1g/ml濃度，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。阿昔洛韋片(Acyclovir，ACV，國藥準(zhǔn)字H19994080，南京瑞爾醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：201304112021，規(guī)格：0.1g/片)，用DMEM培養(yǎng)液初溶，超聲15min藥粉充分溶解，然后用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，配成40mg/ml濃度的藥物母液。以上溶液均 4℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM維持液稀成所需濃度。

1.4 試劑及儀器：四甲基偶氮唑鹽(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)，胎牛血清(FBS)，均購自Sigma;含乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰酶細(xì)胞消化液，GIBCO公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)液，北京鼎國生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Thermo Fisher Scientific 細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國賽默飛世爾科技公司；酶聯(lián)免疫儀，Genios pro，Setifl number， 601000003，芬蘭；倒置顯微鏡，Nikon，Ecllipss Tsl00，日本。

2 方 法

2.1 病毒毒力測定：將對數(shù)生長期的HFF用EDAT的0.25%胰蛋白酶消化，用完全培養(yǎng)基配成細(xì)胞密度為l×105個(gè)/ml單細(xì)胞懸液，接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，37℃，5%CO2培養(yǎng)，細(xì)胞長滿單層進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。HSV-2原液分別用培養(yǎng)基依次10倍稀釋成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-66個(gè)稀釋度。96孔板中的HFF單層用PBS沖洗2次，然后將上述制備好的各稀釋度病毒懸液接種于HFF單層，每孔100μl，各設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)正常細(xì)胞對照孔，37℃孵育2h后吸取出病毒液，加入新的細(xì)胞培養(yǎng)液，200ul/孔，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察記錄細(xì)胞病變(Inhibitation of cytopathic effect，CPE)情況，用Reed-Muench法計(jì)算病毒的致半數(shù)細(xì)胞病變的滴度(Tissue culture infectious dose,TCID50)。CPE程度判定標(biāo)準(zhǔn):(-)示細(xì)胞無病變,(+)示25%的細(xì)胞出現(xiàn)病變,()示25%～50%的細(xì)胞出現(xiàn)病變,()示50%～75%細(xì)胞出現(xiàn)病變,()示75%～100%細(xì)胞出現(xiàn)病變。

2.2 藥物毒性測定：參芪止皰顆粒、ACV用DMEM培養(yǎng)液分別稀釋為6個(gè)濃度(參芪止皰顆粒為10mg/ml、5 mg/ml、2.5 mg/ml、1.25 mg/ml、0.63 mg/ml、0.32 mg/ml；ACV為5.00 mg/ml、2.50 mg/ml、1.25 mg/ml、0.63 mg/ml、0.31 mg/ml、0.16mg/ml)。將HFF接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長成單層后，將稀釋好的各濃度藥物加入到已長成細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板200μl/孔，每濃度做5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察記錄HFF的形態(tài)變化和生長情況，培養(yǎng)3d后，吸出孔內(nèi)液體，PBS洗兩遍，加入MTT液20μl，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入DMSO液200 μl/孔，充分振蕩溶解孔內(nèi)結(jié)晶，用酶聯(lián)免疫儀測定570 nm處吸光度值[5]，計(jì)算細(xì)胞存活率和細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(50%cytotoxity concentration，CC50)。

2.3 藥物直接抑制病毒復(fù)制作用測定：將參芪止皰顆粒、ACV分別自最大無毒濃度倍比稀釋6個(gè)濃度，各濃度藥液分別加入100TCID50病毒液l00 μL混合后，再將藥物病毒液加入96板HFF單層上，每一濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，設(shè)正常細(xì)胞對照組、病毒對照組及陽性藥ACV對照組，37℃ 5%CO2培養(yǎng)72 h，終止培養(yǎng)，MTT法測得各組吸光度值,具體方法同方法2中步驟，并計(jì)算病毒抑制率、半數(shù)抑制病毒有效濃度(Concentration for 50% of maximal effect,EC50)和治療指數(shù)(Therapeutic index，TI) 。

2.4 藥物對病毒感染細(xì)胞的治療作用：長滿96孔單層細(xì)胞去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次。各孔加病毒液100μl,37℃吸附2 h后吸出，用PBS洗去病毒殘留液，加入不同濃度含藥維持液100μl/孔，37℃ 5%CO2培養(yǎng)72h。MTT法測得各組吸光度值，具體方法同方法2中步驟，并計(jì)算藥物對病毒抑制率、EC50和 TI。

2.5 藥物預(yù)防病毒感染細(xì)胞作用：長滿單層的HFF先加入不同濃度含藥細(xì)胞維持液，37℃， 5%CO22 h，棄去含藥細(xì)胞維持液，PBS洗去孔內(nèi)殘留的藥液，加100TCID50HSV-2作用細(xì)胞，37℃ 5%CO2，2 h，棄去殘留病毒液，加入細(xì)胞生長維持液，置37℃，5%CO272 h，MTT法測得各組吸光度值，具體方法同方法2中步驟，并計(jì)算藥物對病毒生長抑制率。

2.6 藥物對病毒復(fù)制抑制的時(shí)相作用：在HSV-2感染細(xì)胞的不同時(shí)間點(diǎn)即：0 h，2 h，4 h，6 h，8 h,10 h加入含2.5mg/ml參芪止皰顆粒細(xì)胞維持液，100μl/孔，37℃ 5%CO2培養(yǎng)，MTT法測得各組吸光度值，具體方法同方法2中步驟，檢測藥物對病毒復(fù)制的抑制作用。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)分析用單因素方差分析方法進(jìn)行，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，則應(yīng)用One．way ANOVA進(jìn)行整體方差分析，用LSD方法進(jìn)行組間多重比較，若方差不齊，則應(yīng)用Welch法進(jìn)行整體方差分析，用DunnettT3方法進(jìn)行組間多重比較；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 病毒毒力 生物光學(xué)倒置顯微鏡下，正常HFF呈梭形，細(xì)胞膜界限清晰，胞漿透明度好，細(xì)胞形態(tài)完整，見圖1中1；病毒所致的細(xì)胞病變表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、腫脹、可見多核巨細(xì)胞或融合細(xì)胞(圖1中2-7)。用Reed-Muench計(jì)算病毒的TCID50為10-4。

圖1 生物倒置顯微鏡下不同稀釋倍數(shù)的HSV-2致HFF細(xì)胞病變觀察(20×10)

2 藥物毒力 參芪止皰顆粒在10 mg/ml濃度時(shí)細(xì)胞存活率仍有73.52%，說明其對HFF的CC50值大于10 mg/ml，表明參芪止皰顆粒對HFF 的毒性作用小。ACV在0.63 mg/ml時(shí)細(xì)胞存活率為51.14%，ACV在0.31 mg/ml時(shí)細(xì)胞存活率為64.84%,最大無毒濃度為0.16 mg/ml。

3 藥物直接抑制病毒復(fù)制作用 參芪止皰顆粒液、ACV各濃度對病毒具有抑制作用，且藥物濃度越大，抑制作用越明顯，與病毒對照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。計(jì)算參芪止皰顆粒液的EC50值為0.30 mg/ml，TI>36，表明其對HSV-2感染HFF具有一定保護(hù)作用。陽性對照藥ACV對HSV-2感染HFF顯示出良好的保護(hù)作用，其EC50為0.018 mg/ml，TI值為67。

4 藥物對病毒感染細(xì)胞的治療作用 參芪止皰顆粒液、ACV各濃度的病毒抑制率與病毒對照組比較，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，且有明顯的量效關(guān)系。經(jīng)計(jì)算參芪止皰顆粒液的EC50值為0.60 mg/ml，TI>25。結(jié)果提示參芪止皰顆粒液對病毒感染后病毒的復(fù)制有一定的治療作用。

5 藥物預(yù)防病毒感染細(xì)胞作用 參芪止皰顆粒在5mg/ml時(shí)，病毒抑制率不超過50%(僅38.94%)，表明參芪止皰顆粒不能阻斷HSV-2病毒入侵細(xì)胞。提示參芪止皰顆粒對HSV-2感染細(xì)胞無預(yù)防作用。

6 藥物不同時(shí)間點(diǎn)對病毒復(fù)制的影響 病毒感染HFF后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)藥物組最后測得的吸光度值與病毒對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HSV-2感染細(xì)胞0 h，2 h后加入藥物病毒增殖抑制率達(dá)到68.65%、73.26%；感染4 h，6 h后加入藥物，病毒增殖抑制率分別達(dá)到59.32%，40.70%；但病毒感染細(xì)胞后8 h再加入藥物進(jìn)行干預(yù)，藥物對病毒復(fù)制抑制作用則明顯減弱，隨著病毒進(jìn)入細(xì)胞的時(shí)間延長，藥物對病毒的復(fù)制的抑制效果也隨之下降，10 h時(shí)病毒增殖抑制率僅為4.65%。提示參芪止皰顆粒液對HSV-2的抑制作用主要在病毒感染細(xì)胞的早期，可能在病毒DAN合成期。

討 論

生殖器皰疹是主要由HSV-2引起的性傳播疾病，以生殖器和肛周出現(xiàn)群集性水皰和淺表潰瘍?yōu)橹饕R床表現(xiàn)。生殖器皰疹可引起胎兒感染和新生兒皰疹，在艾滋病流行地區(qū)，生殖器皰疹增加了HIV 感染的危險(xiǎn)性，女性生殖器皰疹還與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，由于皰疹反復(fù)發(fā)作，部分患者可發(fā)生抑郁癥，嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量[6-7]。病毒細(xì)胞內(nèi)復(fù)制是復(fù)雜但又程序化的過程即：吸附、穿入、脫衣殼、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)合成、核衣殼組裝和病毒的釋放等許多個(gè)環(huán)節(jié)，HSV-2也是如此，因此影響上述復(fù)制循環(huán)中任一環(huán)節(jié)的藥物，均可能具有抗HSV作用[8]。目前核苷類是抗HSV的有效藥物，其中無環(huán)鳥苷的分子基礎(chǔ)是作用于病毒復(fù)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制HSV-2 DNA復(fù)制而不抑制細(xì)胞DNA的合成，而且其臨床應(yīng)用中耐藥的情況很常見，同時(shí)又有一定的腎毒性，因此如何在中草藥中尋找高效的抗HSV-2藥物勢在必行。參芪止皰顆粒方中黃芪、白花蛇舌草、板藍(lán)根和大青葉都有抑制病毒的作用，方中部分中藥具有廣譜抗病毒作用，促進(jìn)機(jī)體誘生干擾素，從而達(dá)到抑制病毒復(fù)制,延緩復(fù)發(fā)的作用[9]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，與細(xì)胞對照組比較，參芪止皰顆粒對HFF毒性作用??；其對HSV-2感染HFF具有一定保護(hù)作用；對病毒的復(fù)制具有一定的抑制作用；對HSV-2病毒吸附入侵細(xì)胞沒有阻斷作用；其對HSV-2復(fù)制的抑制作用時(shí)相主要在感染后0 h、2 h、4 h，是在病毒復(fù)制周期的生物合成階段，可能在DNA復(fù)制階段，與劉建國[10]結(jié)果類似。表明參芪止皰顆粒是一種有效的抗HSV-2感染的方劑，其療效機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

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