替米沙坦延緩大鼠視網(wǎng)膜衰老的作用及機(jī)制

朱江，施葉雯，周歆，姚倩，謝臣，康前雁

(1.西安市第四醫(yī)院眼科，陜西西安710004；2.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西南昌330031；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，陜西西安710061)

隨著年齡的增大，機(jī)體器官會(huì)發(fā)生不可逆的功能退變和衰老。視網(wǎng)膜屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，衰老對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響主要表現(xiàn)為皮質(zhì)變薄、投射軸突減少、突觸丟失、結(jié)構(gòu)改變、神經(jīng)元密度和樹(shù)突減少以及功能退化等方面[1]。既往有研究證實(shí)，隨著年齡增加，大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)變薄，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少，雙極細(xì)胞間突觸聯(lián)系減少，視細(xì)胞外節(jié)層增厚，而替米沙坦可使增厚的視細(xì)胞外節(jié)層變薄，從而延緩視網(wǎng)膜的衰老，但其潛在機(jī)制不明[2]。

視網(wǎng)膜衰老絕大多數(shù)的改變發(fā)生在光感受器細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和Bruch膜層面，這些改變包括細(xì)胞正常功能的喪失和細(xì)胞的丟失，研究顯示這些改變可能是由氧化應(yīng)激、炎癥、慢性光損害及凋亡共同介導(dǎo)的[3]。替米沙坦是一種高效、長(zhǎng)效、低毒的特異性血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體1(AT1)拮抗劑，是臨床高血壓治療的一線用藥。眼球局部也存在腎素-血管緊張素系統(tǒng)，且AngⅡ水平很高，其受體在視網(wǎng)膜中的分布主要以AT1受體為主，它們共同介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)在視網(wǎng)膜病變中起著重要的作用[4]。

很大比例的老年人都在長(zhǎng)期服用替米沙坦，但替米沙坦對(duì)衰老視網(wǎng)膜作用的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)建立大鼠衰老視網(wǎng)膜模型，檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Cu-Zn-SOD、NOX2、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及p38 MAPK、κ基因結(jié)合核因子(nuclear factorκB，NF-κB)磷酸化水平的變化，探索替米沙坦延緩生理性視網(wǎng)膜衰老的潛在作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和模型制作健康無(wú)眼疾SD大鼠40只，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(陜)2007-001]，3個(gè)月齡大小，體重200～250 g，SPF級(jí)，雌雄不限，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)表法將大鼠分為替米沙坦組和對(duì)照組，每組20只。飼養(yǎng)于18℃～22℃明暗各12 h的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，9個(gè)月齡時(shí)開(kāi)始給予干預(yù)，替米沙坦組給予每天8 mg/kg替米沙坦灌胃，對(duì)照組給予等量的生理鹽水灌胃，至17個(gè)月齡[2]。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)“西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)”批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和試劑替米沙坦(德國(guó)Boehringer-Ingelheim公司)、Cu-Zn-SOD抗體(武漢博士德生物工程有限公司)、NOX2抗體(美國(guó)Proteintech生物公司)、Bcl-2抗體(美國(guó)Proteintech生物公司)、Bax抗體(美國(guó)Proteintech生物公司)、SP-9001 HistostainTM-Plus Kit(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、ZLI-9017 DAB Kit(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、p38 MAPK抗體(美國(guó)CST生物公司)、p-p38 MAPK抗體(美國(guó)CST生物公司)、NF-κB抗體(美國(guó)CST生物公司)、p-NF-κB抗體(美國(guó)CST生物公司)、β-Actin抗體(北京全式金公司)、ECL發(fā)光液(美國(guó)Millipore公司)、PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)

1.3 大鼠眼球樣本的提取100 g/L水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉17個(gè)月齡大鼠。0.9%生理鹽水200 mL經(jīng)左心室灌注，灌注成功后摘取眼球，每只實(shí)驗(yàn)大鼠的一側(cè)眼球用于HE和免疫組化染色，于4%多聚甲醛中固定24 h；另一側(cè)眼球取下后沿角鞏緣剪開(kāi)，于4℃PBS中分離完整視網(wǎng)膜組織于滅菌EP管中，-80℃保存用于后續(xù)Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.4 組織病理學(xué)染色和免疫組織化學(xué)染色取固定好的組織常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)切片，片厚4 μm。常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，蘇木素染色2 min；伊紅染色5 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。另取切片，常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，將切片置于金屬抗原修復(fù)架上，浸入0.01 mol/L、pH=6.0的檸檬酸緩沖液中，微波中高火加熱5 min至沸騰，低火加熱12 min，修復(fù)完畢自然冷卻至室溫，3%H2O2去離子水孵育30 min，山羊血清37℃封閉1 h，分別滴加一抗：兔抗大鼠Cu-Zn-SOD抗體(1:400)，兔抗大鼠NOX2抗體(1:200)，兔抗大鼠Bcl-2抗體(1:100)，兔抗大鼠Bax抗體(1:100)，4°C過(guò)夜；復(fù)溫30 min，生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗37℃孵育40 min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素室溫孵育30 min，DAB顯色劑顯色1 min，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核2 min，PBS返藍(lán)5 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀察切片，利用Leica-Q550CW圖像采集與分析系統(tǒng)在40倍物鏡下進(jìn)行圖像采集，隨機(jī)對(duì)每張切片上的視網(wǎng)膜選取5個(gè)視野，Image-Pro Plus 6.0分析每個(gè)視野下陽(yáng)性表達(dá)部位的平均光密度。

1.5 Western blot取出視網(wǎng)膜組織，同一實(shí)驗(yàn)分組中4只大鼠的視網(wǎng)膜組織混合，加入含磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液，冰浴下勻漿器充分勻漿裂解組織，4℃12 000 r/min離心20 min后取上清于新的滅菌離心管中，按體積比加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸蛋白樣品。每個(gè)樣品取10～20μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別孵育一抗：p-38 MAPK兔抗大鼠單克隆抗體(1:1 000)，p-p38 MAPK兔抗大鼠單克隆抗體(1:1 000)，NF-κB兔抗大鼠單克隆抗體(1:1 000)，p-NF-κB兔抗大鼠單克隆抗體(1:1 000)，β-Actin小鼠抗大鼠多克隆抗體(1:3 000)，4℃過(guò)夜；復(fù)溫30 min，TBST洗脫一抗，滴加山羊抗兔和或山羊抗小鼠二抗室溫孵育1 h，TBST洗脫；ECL發(fā)光顯影，采集圖像，Image J軟件分析每個(gè)條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示。對(duì)每組各個(gè)樣本的均數(shù)總體進(jìn)行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差齊性后，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 替米沙坦對(duì)衰老大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)的影響對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列稍顯紊亂，細(xì)胞形態(tài)大小不一，細(xì)胞數(shù)量減少；與對(duì)照組相比，替米沙坦組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列整齊，細(xì)胞形態(tài)基本一致，細(xì)胞丟失減少(見(jiàn)圖1)。與對(duì)照組相比，替米沙坦組大鼠視網(wǎng)膜厚度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.863，P=0.000)。

圖1 兩組大鼠視網(wǎng)膜病理組織學(xué)表現(xiàn)(HE×400)

2.2 替米沙坦對(duì)衰老大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)Cu-Zn-SOD、NOX2表達(dá)的影響替米沙坦組于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層、光感受器細(xì)胞層的內(nèi)節(jié)可見(jiàn)Cu-Zn-SOD強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)照組Cu-Zn-SOD呈弱陽(yáng)性表達(dá)。替米沙坦組及對(duì)照組的Cu-Zn-SOD均于內(nèi)節(jié)表達(dá)相對(duì)明顯，外核層及外節(jié)未見(jiàn)表達(dá)。替米沙坦組較對(duì)照組的Cu-Zn-SOD表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.273，P=0.000)，見(jiàn)圖2、圖3。對(duì)照組于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層、光感受器細(xì)胞層的內(nèi)節(jié)可見(jiàn)NOX2強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，且NOX2于內(nèi)節(jié)表達(dá)相對(duì)明顯，外核層及外節(jié)未見(jiàn)表達(dá)，與對(duì)照組相比，替米沙坦組NOX2的表達(dá)呈弱陽(yáng)性。因此替米沙坦組較對(duì)照組的NOX2表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.446，P=0.000)，見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 替米沙坦組及對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜Cu-Zn-SOD及NOX2的表達(dá)(HE×400)

圖3 替米沙坦組及對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2及Bax的表達(dá)(HE×400)

2.3 替米沙坦對(duì)衰老大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)Bcl-2、Bax表達(dá)及兩者比值的影響替米沙坦組和對(duì)照組于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層、內(nèi)節(jié)可見(jiàn)Bcl-2弱陽(yáng)性表達(dá)，外核層也可見(jiàn)少量Bcl-2弱陽(yáng)性表達(dá)。替米沙坦組與對(duì)照組Bcl-2的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.189，P=0.853)，見(jiàn)圖3、圖4。替米沙坦組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層、內(nèi)節(jié)可見(jiàn)Bax強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而對(duì)照組Bax的表達(dá)呈弱陽(yáng)性。替米沙坦組較對(duì)照組的Bax表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.729，P=0.016)，見(jiàn)圖3、圖4。替米沙坦組Bcl-2/Bax比值較對(duì)照組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.700，P=0.001)，見(jiàn)圖5。

圖4 兩組大鼠視網(wǎng)膜Cu-Zn-SOD、NOX2、Bcl-2及Bax的平均光密度

圖5 兩組大鼠視網(wǎng)膜的Bcl-2/Bax比值

2.4 替米沙坦對(duì)衰老大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)p38 MAPK、NF-κB磷酸化水平的影響與對(duì)照組比較，替米沙坦組p38 MAPK、NF-κB磷酸化水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.454，P=0.01；t=4.474，P=0.018)，見(jiàn)圖6。

圖6 兩組大鼠視網(wǎng)膜p38 MAPK、NF-κB磷酸化水平的變化

3 討論

視網(wǎng)膜局部AngⅡ表達(dá)水平很高，其受體在視網(wǎng)膜中的分布主要以AT1受體為主。沙坦類藥物對(duì)諸多視網(wǎng)膜病變起保護(hù)作用：坎地沙坦對(duì)34%的2型糖尿病視網(wǎng)膜病變有治療作用；氯沙坦可減少缺氧視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)的增加，抑制早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變中新生血管的生成；沙坦類藥物還具有劑量依賴性的降眼壓作用[5-8]。

隨著視網(wǎng)膜的衰老，視網(wǎng)膜平均厚度、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量、毛細(xì)血管數(shù)量、雙極細(xì)胞突觸結(jié)構(gòu)體、感光細(xì)胞間連接、總蛋白等均較年輕時(shí)降低[9]。我們的既往研究表明，大鼠衰老后，視網(wǎng)膜總厚度及多層厚度均明顯變薄，視網(wǎng)膜各層厚度占視網(wǎng)膜總厚度的構(gòu)成比基本不變；且替米沙坦處理衰老大鼠8個(gè)月后，可以顯著減少視網(wǎng)膜厚度的丟失，提示替米沙坦具有延緩視網(wǎng)膜衰老的作用，本研究的結(jié)果與既往研究結(jié)果一致[2]。且本研究通過(guò)檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Cu-Zn-SOD、NOX2、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及p38 MAPK、NF-κB磷酸化水平進(jìn)一步探討了替米沙坦對(duì)衰老視網(wǎng)膜的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)替米沙坦作用衰老大鼠8個(gè)月后，可以增加Cu-Zn-SOD、Bax的表達(dá)，降低NOX2的表達(dá)及p38 MAPK、NF-κB的磷酸化水平，而替米沙坦對(duì)Bcl-2的影響不大。

Cu-Zn-SOD是內(nèi)源性氧自由基清除劑的代表，能歧化超氧陰離子自由基，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞和組織不受自由基的損害，延緩機(jī)體衰老過(guò)程。視網(wǎng)膜易于受到氧化刺激的破壞，而替米沙坦可以增加Cu-Zn-SOD的表達(dá)。NOX2是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶的催化亞基之一，其在衰老大鼠的角膜和晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高，提示其可以介導(dǎo)體內(nèi)活性氧產(chǎn)生，并且參與機(jī)體衰老的病理生理過(guò)程[10-11]。替米沙坦作用大鼠后，可以減少視網(wǎng)膜內(nèi)NOX2、增加Cu-Zn-SOD的表達(dá)，提示替米沙坦可能通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激對(duì)抗機(jī)體衰老。

細(xì)胞凋亡也參與細(xì)胞衰老的過(guò)程[12]。Bcl-2和Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，兩者比值(Bcl-2/Bax)升高，則細(xì)胞趨向存活；反之則趨向凋亡[13]。本研究中，替米沙坦可通過(guò)增加Bax的表達(dá)使Bcl-2/Bax比值較對(duì)照組降低，說(shuō)明替米沙坦可以促進(jìn)衰老視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡。而增加衰老視網(wǎng)膜的凋亡，有助于消除機(jī)體內(nèi)老化和具有潛在性異常生長(zhǎng)的細(xì)胞，從而保持機(jī)體處于穩(wěn)態(tài)起著重要的作用[14]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，替米沙坦對(duì)MAPK及NF-κB信號(hào)通路有抑制作用。機(jī)體衰老后，體內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性增高，AngⅡ及AT受體含量增加，活性氧的合成增加，其可通過(guò)激活MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路使NF-κB活化。NF-κB是參與一系列基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)血管周圍的周細(xì)胞內(nèi)NF-κB被激活時(shí)，促凋亡因子Bax會(huì)過(guò)度表達(dá)，引起周細(xì)胞凋亡、血流動(dòng)力學(xué)異常、血視網(wǎng)膜屏障破壞及視網(wǎng)膜毛細(xì)血管通透性增高[15]。本研究發(fā)現(xiàn)NF-κB被抑制時(shí)，促凋亡因子Bax仍過(guò)度表達(dá)，提示Bax可能受到非NF-κB依賴途徑的調(diào)控。而p38 MAPK信號(hào)通路也被證實(shí)參與氧化應(yīng)激相關(guān)因子SOD和NOX2的調(diào)控。既往研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞衰老依賴于ROS激活p38 MAPK通路，p38 MAPK抑制劑能降低衰老相關(guān)基因p16的表達(dá)；且ROS較低的造血干細(xì)胞功能較強(qiáng)，p38 MAPK表達(dá)較低，p16基本不表達(dá)，提示在造血干/祖細(xì)胞的衰老中，p38 MAPK起著非常重要的作用[16-17]。且視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞處于高糖環(huán)境時(shí)，p38 MAPK激活，并伴隨著SOD的表達(dá)減少；而NOX2則能促進(jìn)p38 MAPKs的激活[18-19]。因此，替米沙坦對(duì)細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的調(diào)控可能與MAPK及NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，替米沙坦可能通過(guò)p38 MAPK及NF-κB途徑，減輕局部視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加大鼠衰老視網(wǎng)膜的細(xì)胞凋亡程度，消除視網(wǎng)膜內(nèi)老化和具有潛在性異常生長(zhǎng)的細(xì)胞，延緩大鼠視網(wǎng)膜的衰老。

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