間充質(zhì)干細(xì)胞臨床前安全性研究概況

張澄，霍艷，黃瑛，高陽，侯田田，肖亞妮，汪巨峰

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間充質(zhì)干細(xì)胞臨床前安全性研究概況

張澄，霍艷，黃瑛，高陽，侯田田，肖亞妮，汪巨峰

100176 北京，中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監(jiān)測中心/藥物非臨床安全評價研究北京市重點實驗室

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）于 1974 年被第一次定義，而后在 20 世紀(jì) 90 年代得到推廣[1]。2006 年，細(xì)胞療法國際協(xié)會針對細(xì)胞表面陽性標(biāo)志物為 MSC 建立了一個最低標(biāo)準(zhǔn)，即 CD90+、CD105+、CD73+、CD45–、CD34–、CD14–、CD79–、HLA–、DR–[2]。最初的臨床試驗中，MSC 主要是用于成骨不全[3]或黏多糖癥的研究。近年來研究表明，MSC 也具備促血管生成、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、營養(yǎng)支持等生物活性，這為其用于缺血性、炎性疾病等方面的治療提供了可能性[4]。另外MSC 在實驗中易于獲得、可在體外大量擴(kuò)增及有多系分化潛能的性質(zhì)也表明其可成為組織工程的一個強(qiáng)有力工具[5]。

1 治療機(jī)制及研究進(jìn)展

臨床前研究表明，MSC 一般通過自身分化、營養(yǎng)支持、免疫調(diào)節(jié)等機(jī)制發(fā)揮治療作用[6]。間充質(zhì)干細(xì)胞可由一系列組織分離得到，同時在一定條件下可分化成不同的祖細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及造血支持基質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞進(jìn)一步可分化為心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。同時，MSC 可通過自分泌或旁分泌途徑釋放細(xì)胞因子，這些活性物質(zhì)可定向聚集于特定部位起到抑制細(xì)胞凋亡、纖維化，促進(jìn)血管生成或緩解炎性反應(yīng)等作用[7]。另外，MSC 在體內(nèi)可通過免疫調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，借此治療一些炎性疾病。最新研究表明，干細(xì)胞可能并沒有免疫豁免的機(jī)制，其可能是通過免疫逃逸機(jī)制來實現(xiàn)相關(guān)治療作用的[8]。

MSC 雖然在很多領(lǐng)域展現(xiàn)出極大潛力，但現(xiàn)今的研究仍面臨很多挑戰(zhàn)。臨床試驗雖然正在大力進(jìn)行，但數(shù)據(jù)仍較為缺乏。臨床前研究中，動物模型、干細(xì)胞來源、體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化選擇目前都沒有一個明確的規(guī)定。不同來源的人源干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、分化方向也有很大差異。

2 安全風(fēng)險因素

由于細(xì)胞自身生物學(xué)或?qū)嶒灢僮鞯雀鞣N因素，干細(xì)胞在應(yīng)用于臨床或基礎(chǔ)實驗的過程中存在一定安全風(fēng)險，主要可分為內(nèi)源性風(fēng)險、外源性風(fēng)險及其他生物風(fēng)險。

內(nèi)源性風(fēng)險主要包括：①干細(xì)胞腫瘤形成相關(guān)風(fēng)險。干細(xì)胞具有不斷增殖、對凋亡誘導(dǎo)不敏感等與腫瘤細(xì)胞相似的生長調(diào)控機(jī)制。有研究表明，胚胎干細(xì)胞（ESC）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）可引發(fā)良性或惡性的畸胎瘤，同時有研究表明高代次的鼠源 MSC 可自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化。干細(xì)胞也可能影響體內(nèi)已存在的腫瘤細(xì)胞的生長和擴(kuò)增，即干細(xì)胞的“促瘤性”[9]。②干細(xì)胞免疫學(xué)相關(guān)風(fēng)險。實驗中需要考慮細(xì)胞的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)帶來的生物學(xué)風(fēng)險。ESC 未分化前的免疫原性很低，但在分化后由于 MHC 分子的表達(dá)可表現(xiàn)出較高的免疫原性。同時體外實驗表明，ESC 和 MSC 可通過調(diào)控 T 細(xì)胞、單核細(xì)胞及 NK 細(xì)胞等的增殖分化來調(diào)節(jié)生物免疫能力。③干細(xì)胞由于自身攜帶的傳染性疾病、未知或罕見的病原體、遺傳性疾病等而產(chǎn)生的風(fēng)險。外源性風(fēng)險主要包括：細(xì)菌、真菌、支原體及病毒污染[10]，一般來自于實驗操作、細(xì)胞庫污染和動物基質(zhì)細(xì)胞污染等方面[11]。與內(nèi)源性風(fēng)險相比，外源性風(fēng)險污染途徑多，防控更為復(fù)雜。

另外由于干細(xì)胞的體內(nèi)歸巢和分化機(jī)制仍不明確[12]，干細(xì)胞進(jìn)入機(jī)體內(nèi)可能存在非靶向部位轉(zhuǎn)移、目標(biāo)以外的 分化或去分化等風(fēng)險。同時當(dāng)大劑量的細(xì)胞被注射進(jìn)入體內(nèi)，可能阻塞在注射區(qū)域，嚴(yán)重的可導(dǎo)致注射區(qū)域組織壞死等情況。

3 臨床前安全性研究概況

MSC 臨床前安全評價一般分為兩部分：一般毒性評價和干細(xì)胞特定安全評價。一般毒性評價包括行為觀察、臨床癥狀、血液生化測定、死亡率、組織病理檢查等。干細(xì)胞特定安全評價包括致瘤性、生物分布等。其中一般毒性評價和一般生物制品的評價方式相似。另外目前針對干細(xì)胞特定的安全評價也已有一定的研究，但仍缺乏專門針對干細(xì)胞評價的相關(guān)文件規(guī)范進(jìn)行指導(dǎo)。

干細(xì)胞安全評價實驗設(shè)計中需考慮動物模型、給藥途徑、實驗周期等相關(guān)因素。①動物模型：考慮到異種排斥，建議選擇免疫缺陷或免疫抑制類動物，如 NOD/SCID 小鼠、nu/nu 小鼠等，但也需考慮到該類動物壽命較短（12 ~18 個月），且可能產(chǎn)生自發(fā)腫瘤影響實驗結(jié)果[13]。同時也有研究選擇食蟹猴、狒狒等非人靈長類動物，這類動物模型存在數(shù)據(jù)采集困難、需進(jìn)行免疫抑制操作等缺點。②給藥途徑：盡量和臨床保持一致，實驗中采用的給藥途徑主要有靜脈注射、皮下注射和肌肉注射等方式。③實驗周期：依據(jù)實驗?zāi)康暮蛣游锓N類的不同，需制定不同的實驗周期。免疫缺陷的嚙齒類動物的實驗周期自 8 d ~ 8 個月不等，但需考慮到超過 6 個月時動物可能產(chǎn)生自發(fā)性腫瘤，影響實驗進(jìn)程和結(jié)果。目前采用食蟹猴為動物模型的評價實驗主要是在一般毒性研究，實驗周期從 4 ~ 6 周不等。④細(xì)胞劑量：研究報道MSC 輸注患者所需細(xì)胞數(shù)為（1.0 ~ 2.0）×106cells/kg[14]，動物實驗中則需依據(jù)不同動物種類換算得出具體的細(xì)胞劑量。

3.1 一般毒性

目前已有多項研究進(jìn)行了 MSC 的一般毒性實驗。Creane 等[15]單次肌肉注射骨髓來源MSC 至免疫缺陷小鼠，3 個月的實驗周期內(nèi)未見實驗動物的體重、飲食、病理學(xué)等相關(guān)指征變化。Ramot 等[16]以 NOD/SCID 小鼠為模型，通過單次或 3 次肌肉注射胎盤來源 MSC 進(jìn)行了為期 3 個月的毒性反應(yīng)試驗，未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)癥狀。Ra等[17]通過單次尾靜脈注射脂肪來源 MSC 至 SCID 小鼠，13 周內(nèi)高劑量下（2.5 × 108cells/kg）未見明顯毒性反應(yīng)。海泉等[18]以小鼠、大鼠、裸鼠為評價模型，考察人源 UC-MSC 進(jìn)入動物體內(nèi)后的急性毒性反應(yīng)和長期毒性反應(yīng)。急性實驗中細(xì)胞劑量可達(dá) 1.25 × 108cells/kg，長期毒性實驗中細(xì)胞量為 2.5 × 106~ 1 × 107cells/kg，該實驗表明干細(xì)胞不會導(dǎo)致明顯毒性反應(yīng)。王冠華等[19]以 ICR 小鼠為動物模型，通過單次尾靜脈給藥評價 MSC 的急性毒性反應(yīng)。結(jié)果表明，MSC 無明顯的毒性反應(yīng)，但在肺臟和脾臟等部位有滯留。另外也有一些研究選擇食蟹猴為動物模型，給藥周期為 4 ~ 6 周，給藥途徑為單次或多次靜脈注射、腦內(nèi)注射等[20]。一般檢測指標(biāo)主要包括：行為、體重、體溫、心電圖、血細(xì)胞計數(shù)、凝血功能、血液、尿液等。

3.2 生物分布

生物分布關(guān)系到細(xì)胞在各組織臟器中的遷移、聚集、分化等情況。研究表明，干細(xì)胞移植入體內(nèi)后的遷移情況同細(xì)胞的來源、傳代次數(shù)、培養(yǎng)條件、植入方式、細(xì)胞因子及其受體相關(guān)[21]。有研究表明，MSC 移植到體內(nèi)后可聚集到特定的損傷組織通過分泌相關(guān)因子發(fā)揮作用[22]，但也有研究表明由于干細(xì)胞的大體積和表面黏附受體，大多數(shù) MSC 可阻塞在肺部形成栓塞[23]，鑒于目前對干細(xì)胞在體內(nèi)分布的情況和危害仍不清楚，進(jìn)行相關(guān)研究具有重要意義。

目前干細(xì)胞生物分布研究主要是細(xì)胞進(jìn)行體外標(biāo)記后再移植入體內(nèi)，其中主要標(biāo)記方式有熒光素酶[24]、綠色熒光蛋白（GFP)、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）、近紅外染料標(biāo)記[25]等。相應(yīng)地出現(xiàn)了包括生物發(fā)光成像、單光子發(fā)射 CT 掃描、磁共振成像等檢測方法。同時通過 PCR、流式檢測干細(xì)胞表面標(biāo)志物等方法也可以對生物分布進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測。生物發(fā)光或磁共振成像屬于活體成像技術(shù)，這項技術(shù)可減少動物使用數(shù)量和實驗解剖工作量。而在一些實驗周期較短的研究中則可采用染料（如：近紅外熒光色素等）染色的方法進(jìn)行研究。

3.3 致瘤性

干細(xì)胞一般可分化成三類腫瘤：畸胎瘤、畸胎癌和繼發(fā)性腫瘤[26]。研究表明干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞具有很多相似的特性，例如凋亡抵抗特性、自我復(fù)制能力和相似的生長調(diào)控機(jī)制。實驗動物模型方面，由于人源干細(xì)胞在動物身上進(jìn)行實驗時可能會有免疫排斥反應(yīng)，所以在致瘤性實驗中通常采用免疫缺陷小鼠（如 NOD/SCID 小鼠、裸鼠等），這類動物由于缺乏免疫系統(tǒng)往往更易產(chǎn)生自發(fā)腫瘤。聶德志等[27]將神經(jīng)干細(xì)胞和 MSC 移植入 BALB/c 裸鼠體內(nèi)進(jìn)行為期 12 周的致瘤性實驗，結(jié)果顯示短期傳代后的干細(xì)胞沒有致瘤性。秦秀軍等[28]則考察了脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在裸鼠體內(nèi) 6 個月的致瘤性情況，也未發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞的致瘤傾向。Ra等[17]在 BALB/c-nu 上進(jìn)行了為期 26 周的致瘤試驗，單次皮下注射 2 × 108cells/kg 條件下試驗周期內(nèi)未見腫瘤形成。但同樣有研究發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射 MSC 至免疫抑制小鼠體內(nèi)，可導(dǎo)致肉瘤產(chǎn)生[29]。所以需要進(jìn)一步的實驗數(shù)據(jù)來得到致瘤性結(jié)論。

4 結(jié)語

目前，MSC 在諸多領(lǐng)域都展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景，但其安全性相關(guān)的數(shù)據(jù)和文件仍比較欠缺[30]，其生物分布、致瘤性和免疫原性等特定的安全評價試驗均有別于其他生物制品，研究中應(yīng)在一般毒性實驗的基礎(chǔ)之上，納入細(xì)胞評價的相關(guān)安全性評價指標(biāo)，力求全面完整地對間充質(zhì)干細(xì)胞的安全性進(jìn)行評價。

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霍艷，Email：yanhuo@nifdc.org.cn

2018-05-24

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.011