家蠶蛹致敏原蛋白的研究進(jìn)展

唐 健 趙國(guó)棟 錢(qián)荷英 李 剛 周凱月 徐安英

(1江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院， 江蘇鎮(zhèn)江 212018； 2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所， 江蘇鎮(zhèn)江 212018)

家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，在我國(guó)從事栽桑養(yǎng)蠶的農(nóng)民有1 000多萬(wàn)戶(hù)[1]。家蠶蛹因含有極其豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包含大量的人體必需氨基酸以及飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸，成為人們喜愛(ài)的食物之一，此外家蠶蛹還含有維生素、甲殼素、多糖類(lèi)物質(zhì)、微量的抗菌肽、溶菌酶、激素等生物活性物質(zhì)，而且家蠶蛹中還含有大量的硒元素，可用于傳統(tǒng)抗癌藥物[2]。但是在食用家蠶蛹時(shí)有少數(shù)人會(huì)發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，出現(xiàn)頭暈、頭痛等癥狀，究其原因主要是因?yàn)榧倚Q蛹中存在一些致敏原。為此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了對(duì)家蠶蛹致敏原的相關(guān)研究。本文綜述了家蠶致敏原的致敏方式、臨床表現(xiàn)及對(duì)家蠶致敏成分進(jìn)行了分析，并在敘述家蠶蛹致敏原檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上，從30K家族蛋白等6類(lèi)致敏蛋白總結(jié)了家蠶蛹致敏原分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，以期為家蠶過(guò)敏性疾病的研究和特色食用蠶品種的培育開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1 致敏原研究概況

正常情況下，人體會(huì)通過(guò)產(chǎn)生抗體來(lái)防御外源有害物質(zhì)的侵入，食物過(guò)敏是機(jī)體把無(wú)害物質(zhì)誤認(rèn)為有害物質(zhì)而產(chǎn)生抗體的一種病癥，這種引起人體發(fā)生食物過(guò)敏的物質(zhì)就是致敏原[3]。致敏原也叫過(guò)敏原或者變應(yīng)原，絕大多數(shù)的致敏原是蛋白質(zhì)，它是指能夠選擇性刺激機(jī)體內(nèi)的免疫物質(zhì)，從而誘導(dǎo)其產(chǎn)生特異性的免疫球蛋白，介導(dǎo)I型過(guò)敏反應(yīng)[3]。一般致敏原是具有酸性等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)，因其要穿過(guò)人體的粘膜表面，所以具有較小的分子量和水溶性[3]。

在過(guò)去的幾十年內(nèi)，各國(guó)的科研工作者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了上千種致敏原，包括植物源性致敏原和動(dòng)物源性致敏原，從現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料來(lái)看，大部分植物源性致敏原不是分散在各個(gè)蛋白質(zhì)家族中，而是僅存在于27個(gè)蛋白質(zhì)家族中，而且主要分布在醇溶蛋白超家族、Cupin超家族、Bet v 1家族和Profilins家族；而動(dòng)物源性致敏原主要集中于原肌球蛋白家族、鈣離子結(jié)合蛋白家族和酪蛋白家族，由此說(shuō)明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對(duì)其功能以及生物活性有著至關(guān)重要的作用[4]。

2 家蠶致敏原的致敏方式及致敏成分的分析

2.1 家蠶致敏原的致敏方式

目前，引起人們發(fā)生家蠶過(guò)敏的方式大致分為吸入性過(guò)敏、接觸性過(guò)敏和食入性過(guò)敏3類(lèi)[2]。吸入性過(guò)敏：由于家蠶的廣泛養(yǎng)殖，蠶絲制品的普遍使用，使得在加工過(guò)程中，偶有絲塵顆粒漂浮于空氣中而被人體吸收，引發(fā)一系列過(guò)敏反應(yīng)[5]；另外，在雌雄蛾交配時(shí)產(chǎn)生的鱗毛懸浮于空氣中，也可被人體吸入，引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)[6]。接觸性過(guò)敏：家蠶過(guò)敏的患者接觸到蠶絲制品時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏；另外，在醫(yī)學(xué)上絲質(zhì)縫合線(xiàn)也有引起患者過(guò)敏的案例發(fā)生[7-8]。食入性過(guò)敏：在我國(guó)廣大養(yǎng)蠶地區(qū)一直有食用蠶蛹的習(xí)慣，少數(shù)人也會(huì)出現(xiàn)食用蠶蛹導(dǎo)致過(guò)敏的現(xiàn)象[9]。

2.2 家蠶致敏的臨床表現(xiàn)

當(dāng)大量的鱗毛被人體吸入后，大部分的人會(huì)出現(xiàn)咳嗽反應(yīng)，如此反復(fù)甚至發(fā)展成哮喘。在日本，引起過(guò)敏性鼻炎的重要因素之一就是吸入蠶蛾的鱗毛[10]。家蠶蛹在傳統(tǒng)中醫(yī)中可作為一種藥物而被用來(lái)治療高血壓和脂肪肝，但是食用蠶蛹過(guò)敏的患者常會(huì)出現(xiàn)頭暈、頭痛、惡心、嘔吐等癥狀[11]。在蠶種場(chǎng)或者繅絲廠，也有對(duì)蠶絲過(guò)敏的患者出現(xiàn)，并且有調(diào)查研究顯示，兒童哮喘的發(fā)病率與該地區(qū)的絲制品使用率存在正相關(guān)性[12]。

2.3 家蠶致敏原的致敏成分

2.3.1 幼蟲(chóng)致敏原成分分析 2007年，深圳大學(xué)研究人員發(fā)現(xiàn)家蠶的1～4齡幼蟲(chóng)中均含有82 kD和79 kD的特異性致敏原，并且在每個(gè)時(shí)期都有微量的其他致敏原出現(xiàn)，但在5齡蠶體內(nèi)卻產(chǎn)生了新的特異性致敏原為30 kD的蛋白質(zhì)，提示家蠶在不同時(shí)期的致敏原成分會(huì)發(fā)生變化[13]。

2.3.2 蠶蛹致敏原成分分析 家蠶蛹是由家蠶幼蟲(chóng)發(fā)育轉(zhuǎn)化而來(lái)的，由于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，含有豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸以及其具有的藥用價(jià)值，所以我國(guó)有很大一部分人食用蠶蛹，但其中有極少數(shù)人食用蠶蛹會(huì)發(fā)生蠶蛹過(guò)敏反應(yīng)。針對(duì)極少數(shù)人食用蠶蛹會(huì)發(fā)生過(guò)敏這一現(xiàn)象，深圳大學(xué)變態(tài)反應(yīng)疾病研究實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了家蠶蛹致敏原的研究，通過(guò)對(duì)家蠶蛹蛋白的分離，發(fā)現(xiàn)了27～138 kD的蛋白質(zhì)組分，并運(yùn)用免疫印跡學(xué)技術(shù)鑒定到了其主要致敏原為82 kD、79 kD、30 kD的蛋白質(zhì)，其中30K蛋白是家蠶蛹的主要致敏原[14]。

2.3.3 蠶絲致敏原成分分析 蠶絲是家蠶最主要的致敏原，由絲膠和其包裹著的三角形或者橢圓形的絲素組成，其中絲膠占30%、絲素占70%；絲膠是蠶絲致敏原的主要成分，它能夠誘導(dǎo)免疫球蛋白作用機(jī)制的發(fā)生[15]。在加工蠶絲過(guò)程中，優(yōu)良的蠶絲被制作成絲綢，品質(zhì)差一點(diǎn)的蠶絲被用作填充物制作成相關(guān)的絲織品。在絲綢制作過(guò)程中，會(huì)用熱堿水反復(fù)洗滌，使絲膠蛋白去除，所以生活中的絲綢一般不會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)[16]。隨著電泳技術(shù)的發(fā)展，對(duì)蠶絲蛋白的分離有了越來(lái)越清楚的研究， DEWAIR等[17]最早將蠶絲蛋白分離為分子量在14～70 kD之間的12種多聚肽，并且檢測(cè)到與過(guò)敏患者的血清有高度結(jié)合的IgE(人體的一種抗體)。而ZAOMING等[18]分離出13種蛋白條帶，并且發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)致敏原成分的蛋白集中在35～50 kD之間。近年北京協(xié)和醫(yī)院證實(shí)了13條多聚肽，分布于97.2 kD以下，主要的條帶在21.9 kD以下，然后通過(guò)Western blotting驗(yàn)證出識(shí)別過(guò)敏患者血清的蛋白帶主要在35.1～50.0 kD之間和21.9 kD以下[19]。

3 家蠶蛹致敏原的檢測(cè)技術(shù)和分子生物學(xué)研究

3.1 家蠶蛹致敏原的檢測(cè)技術(shù)

目前實(shí)驗(yàn)室中家蠶蛹致敏原的檢測(cè)技術(shù)一般分為基于核酸的檢測(cè)技術(shù)和基于蛋白的檢測(cè)技術(shù)。

3.1.1 基于核酸的檢測(cè)技術(shù) 主要是利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，經(jīng)過(guò)變性、退火、延伸等幾步反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行，體外擴(kuò)增出目的致敏原基因片段，再通過(guò)檢測(cè)編碼致敏原基因是否存在，從而說(shuō)明致敏原存在的可能性，這種方法穩(wěn)定、高效、實(shí)用，因?yàn)镈NA比蛋白質(zhì)穩(wěn)定得多，耐熱性也相對(duì)較好，而且蛋白質(zhì)在提取的過(guò)程中很容易失活，尤其當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量較低時(shí)[20]。近年來(lái)PCR的使用得到普遍的推廣，并已成熟發(fā)展為一種標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法，只要有微量的目的基因就可以被擴(kuò)增出來(lái)從而被檢測(cè)到，這大大彌補(bǔ)了蛋白檢測(cè)技術(shù)的缺陷[21]。YANO等[22]運(yùn)用PCR方法對(duì)加工過(guò)的胡桃進(jìn)行了殘留致敏原的檢測(cè)，為PCR檢測(cè)技術(shù)開(kāi)啟了一個(gè)良好的開(kāi)端。劉碩等[23]成功地利用PCR技術(shù)克隆表達(dá)出家蠶蛹致敏原幾丁質(zhì)酶基因，為PCR技術(shù)在蠶蛹致敏原檢測(cè)中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)進(jìn)行PCR實(shí)時(shí)檢測(cè)，該方法可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)到致敏原基因的表達(dá)情況，從而可以判斷出食品中致敏原基因的含量[24]。董薇等[25]首次采用RT-PCR技術(shù)對(duì)芝麻中致敏成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明RT-PCR對(duì)芝麻致敏原基因十分靈敏，靈敏度可達(dá)到1 mg/kg，符合痕量檢測(cè)的要求，這為RT-PCR技術(shù)應(yīng)用于蠶蛹致敏原檢測(cè)提供了實(shí)現(xiàn)的可能。

3.1.2 基于蛋白的檢測(cè)技術(shù) 從檢測(cè)方法上來(lái)說(shuō)，此項(xiàng)技術(shù)是依據(jù)色譜學(xué)、質(zhì)譜學(xué)、免疫學(xué)方法建立的，而免疫學(xué)方法主要又有酶聯(lián)免疫法、酶標(biāo)記過(guò)敏原吸附法、放射過(guò)敏原吸附法、火箭免疫電泳法等，其中酶聯(lián)免疫法是目前檢測(cè)食物過(guò)敏原最主要的方法，其原理是通過(guò)酶標(biāo)記的抗體與靶向抗原或蛋白結(jié)合，同時(shí)伴隨著顏色反應(yīng)，然后通過(guò)測(cè)定顏色反應(yīng)的有無(wú)或顏色的深淺程度來(lái)進(jìn)行定性定量分析，該方法準(zhǔn)確、高效、靈敏、操作方便[26]。

3.2 家蠶蛹致敏原分子生物學(xué)研究

目前發(fā)現(xiàn)的家蠶蛹致敏原蛋白大致有6類(lèi)，包括30K家族蛋白、幾丁質(zhì)酶、熱休克蛋白20.8、卵黃原蛋白、家蠶血液胰凝乳蛋白酶抑制劑和丙糖磷酸鹽異構(gòu)酶[27]。

3.2.1 30K家族蛋白 30K蛋白是家蠶特有的一類(lèi)低分子量的脂蛋白，它由脂肪體合成，然后分泌到血液當(dāng)中，成為家蠶生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的貯藏蛋白之一。30K蛋白的功能復(fù)雜多樣，除了為家蠶蛹期和卵的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源以外，還可能參與到免疫和細(xì)胞凋亡等重要的生物學(xué)過(guò)程。2007年，劉志剛等[13]從不同時(shí)期家蠶的提取液中分離出20條左右的蛋白條帶，并且成功地分離純化出5齡蠶新出現(xiàn)的30 kD的特異性致敏原，并通過(guò)MALDI-TOF-MS鑒定出其為外膜蛋白，可能是5齡蠶發(fā)育過(guò)程中家蠶體壁出現(xiàn)的新蛋白組分，并且轉(zhuǎn)移到家蠶蛹中。2017年，曹會(huì)等[28]成功克隆出家蠶蛹30K脂蛋白家族成員Bmlp7的融合蛋白，并發(fā)現(xiàn)其是一種潛在的致敏原，這為30K脂蛋白的研究做出了重大的貢獻(xiàn)。

3.2.2 幾丁質(zhì)酶 幾丁質(zhì)酶是催化幾丁質(zhì)水解生成N-乙酰葡萄糖胺反應(yīng)的酶，它可以消化吸收老化的角質(zhì)層。劉碩等[23]成功克隆家蠶蛹主要過(guò)敏原幾丁質(zhì)酶基因并構(gòu)建了原核表達(dá)載體，分析出該基因含有長(zhǎng)度為1 668 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼555個(gè)氨基酸；該蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為61 500，等電點(diǎn)為5.78，編碼序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的家蠶蛹幾丁質(zhì)酶基因的同源性為99%，為家蠶蛹過(guò)敏原幾丁質(zhì)酶的重組表達(dá)和免疫活性鑒定等奠定了基礎(chǔ)。2016年，趙祥杰等[29]通過(guò)生物學(xué)信息軟件的分析，對(duì)蠶蛹糖水解酶18家族幾丁質(zhì)酶的同源性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、親疏水性、可塑性、表面可及性和抗原性等進(jìn)行了綜合分析，確定其抗原表位位點(diǎn)，為深入開(kāi)展該致敏原的免疫學(xué)特性研究打下了基礎(chǔ)，并為家蠶蛹蛋白的脫敏研究提供了理論基礎(chǔ)。

3.2.3 熱休克蛋白20.8 熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)是動(dòng)植物在受到高溫、高壓、饑餓或者細(xì)菌感染等不利因素的刺激下，應(yīng)激產(chǎn)生的一種遺傳上高度保守的特異性蛋白，它會(huì)幫助機(jī)體在非正常情況下恢復(fù)功能[30]。它的種類(lèi)繁多，一般按照分子量分為90 家族(分子量約 83～90 kD)、70 家族(分子量約 66～78 kD)、60 家族(分子量約 60 kD)和小分子量家族(分子量約 15～39 kD)等4個(gè)家族[31]。家蠶蛹熱休克蛋白20.8(BmHSP20.8)屬于小分子量家族，可以作為分子伴侶，在蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性中發(fā)揮重要作用，同時(shí)它也被證明在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用[32]。劉碩[27]為了更清楚地了解熱休克蛋白，從家蠶蛹中成功克隆表達(dá)出BmHSP20.8，并證實(shí)了其致敏原性。2014年，王嬋[33]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)BmHSP20.8只存在于線(xiàn)粒體中，并發(fā)現(xiàn)BmHSP20.8的線(xiàn)粒體定位信號(hào)區(qū)域由該蛋白基因開(kāi)放閱讀框的427～561 bp區(qū)域編碼，位于該蛋白C端的143氨基酸至186氨基酸區(qū)域，還通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了BmHSP20.8具有分子伴侶活性，這一結(jié)果為研究家蠶小熱休克蛋白功能奠定了基礎(chǔ)。2009年，張靜[34]篩選家蠶蛹期cDNA文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)1條已知的家蠶小熱休克蛋白的基因BmHSP21.4，將其成功克隆表達(dá)，并通過(guò)熒光定量PCR和Western blotting免疫印跡分析，推測(cè)其與家蠶的變態(tài)發(fā)育無(wú)關(guān)。

3.2.4 卵黃原蛋白 卵黃原蛋白(vitellogenin Vg)是卵黃磷蛋白的前體，是卵形成和胚胎發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，主要在卵生動(dòng)物的雌性脂肪體中合成，通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入卵巢，以卵黃顆粒的形式被儲(chǔ)存和利用[35]。2014年，羅娟等[36]以家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，分析了基因在家蠶染色體上的位置，預(yù)測(cè)了蛋白的結(jié)構(gòu)以及進(jìn)化的趨勢(shì)等，并發(fā)現(xiàn)家蠶卵黃原蛋白(BmVg)在雌性家蠶脂肪體中大量表達(dá)，并且持續(xù)到整個(gè)蛹期。卵黃原蛋白在白鯨魚(yú)子醬[37]和鮭魚(yú)卵[38]中被鑒定為致敏原。

3.2.5 家蠶血液胰凝乳蛋白酶抑制劑 家蠶血液胰凝乳蛋白酶抑制劑是家蠶血液中重要的蛋白酶抑制劑，主要存在于脂肪體、生殖腺和血液等部位，包括多個(gè)成員，具有豐富的多態(tài)性[39]。2006年，李娟等[40]發(fā)現(xiàn)了家蠶血液胰凝乳蛋白酶抑制劑在群體水平上的多態(tài)性分布，家蠶血液胰凝乳蛋白酶抑制劑廣泛存在于不同家蠶品系中，同時(shí)其多態(tài)性的分布特征也表明其生理功能在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了明顯的分化。2013年，趙萍等[41]對(duì)胰凝乳蛋白酶抑制劑在蓖麻蠶主要組織中的分布及血液中的含量和活性做了探究，與家蠶血液中的含量相比，蓖麻蠶血液中的胰凝乳蛋白酶抑制劑含量更高，胰凝乳蛋白酶抑制劑種類(lèi)多態(tài)性分布不僅體現(xiàn)在不同品系的同一組織，還體現(xiàn)在同一品系的不同組織。

3.2.6 丙糖磷酸鹽異構(gòu)酶 針對(duì)丙糖磷酸鹽異構(gòu)酶致敏原的深入研究較少，我們還需要進(jìn)一步地探索。

除此之外，2016年WANG等[42]運(yùn)用分子生物學(xué)和蛋白組學(xué)的方法從家蠶蛹中發(fā)現(xiàn)6種潛在的致敏原，分別為熱休克蛋白20.4、表皮蛋白類(lèi)30前體(CPH30)、表皮蛋白R(shí)R-2基序63(CPR63)、硫醇過(guò)氧化還原酶、LOC101743840，并且利用免疫學(xué)技術(shù)驗(yàn)證了硫醇過(guò)氧化還原酶的致敏原性。之后多位學(xué)者相繼驗(yàn)證出其余5種致敏原的致敏原性。2016年，MA等[43]成功地克隆表達(dá)出化學(xué)感受蛋白5前體CSP5基因，鑒定其免疫學(xué)特性，采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)CSP5蛋白的理化性質(zhì)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、潛在B細(xì)胞抗原表位。梁志林等[44]成功克隆出家蠶蛹表皮蛋白R(shí)R-2基序63(CPR63)基因，并且通過(guò)免疫學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其能夠與蠶蛹過(guò)敏患者血清IgE結(jié)合，證實(shí)了重組CPR63蛋白具有良好的免疫原性，用Prot Param Tools預(yù)測(cè)出其穩(wěn)定的理化性質(zhì)；用PSIPRED和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)主要是以無(wú)規(guī)則卷曲組成。HU等[45]鑒定出家蠶蛹CPH30蛋白，之后合成該基因，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，成功克隆表達(dá)出CPH30蛋白，證實(shí)其免疫原性，并預(yù)測(cè)出其氨基酸序列的第57～69位和第150～158位為潛在的B細(xì)胞表位。2017年，梁志林等[46]克隆表達(dá)了LOC101743840基因，驗(yàn)證了其致敏原性，并且預(yù)測(cè)出蛋白的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、抗原表位，這些都為進(jìn)一步研究家蠶蛹的致敏原成分奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)語(yǔ)

家蠶蛹蛋白是一種極富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的自然資源，可作為開(kāi)發(fā)食品、醫(yī)藥用品等的優(yōu)質(zhì)原料，同時(shí)也是一種人體所需的優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白來(lái)源，但是由于其可能導(dǎo)致的致敏問(wèn)題，近年來(lái)在學(xué)術(shù)上引起了廣泛的關(guān)注，隨著分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，有關(guān)家蠶蛹的致敏原研究將會(huì)不斷深入，期望早日制備出高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)致敏原從而應(yīng)用于蠶蛹過(guò)敏性疾病的診斷和治療，同時(shí)從家蠶種質(zhì)資源的源頭出發(fā)，篩選出無(wú)致敏原和少致敏原的家蠶種質(zhì)資源，為特色的食用家蠶品種的研發(fā)、選育和推廣提供基礎(chǔ)。