驢人工授精技術(shù)的研究進(jìn)展

郝志明，景兆國，沈鴻武

（1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)科系，天津 300384；2.甘肅龍麒生物科技股份有限公司，瓜州 736100）

由于牛和豬等動(dòng)物人工授精技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，使得人們認(rèn)為驢的人工授精技術(shù)也很成熟，但事實(shí)上驢的人工授精的受胎率并不高，鮮精的情期受胎率多在30%～50%之間，凍精的受胎率則更低（0～36%）。2006年，Oliveira等［1］通過冷凍劑對驢精液影響的研究發(fā)現(xiàn)，同樣的驢凍精，給驢人工授精的受胎率為0%（0/53），而在馬上則為40%（4/10）。即使在理論上，如卵子維持受精能力的時(shí)間也不確定，有的說驢與馬一樣，有的則認(rèn)為更短。因此，有關(guān)驢人工授精技術(shù)還有很多方面需要深入研究解決，也需要對已有的研究成果進(jìn)行總結(jié)，以期指導(dǎo)未來的研究方向和生產(chǎn)實(shí)踐。

1 精液稀釋液對受胎率的影響

在驢的人工授精過程中，若用原精液，其受胎率并不遜于馬，但原精若用稀釋液進(jìn)行稀釋，其受胎率一般僅在40%左右，遠(yuǎn)不如馬的受胎率。為了克服精液稀釋液的影響，幾十年來人們進(jìn)行過很多研究，但進(jìn)展與人們的期望值還有不小的距離。

1.1 基礎(chǔ)稀釋液

Rossi等［2］分別用脫脂奶粉-葡萄糖稀釋液和卵黃-甘氨酸稀釋液作為基礎(chǔ)稀釋液，將稀釋后的驢新鮮精液輸入母馬子宮，結(jié)果顯示，脫脂奶粉-葡萄糖稀釋液組母馬的受胎率為64.52%，卵黃-甘氨酸稀釋液組為61.11%。Carvalho等［3］用低溫保存的中段驢精液給母馬進(jìn)行人工授精，受精母馬的情期受胎率脫脂奶粉-葡萄糖稀釋液組為56.52%（13/23），乳糖-卵黃稀釋液組僅4.76%（1/21）。說明脫脂奶粉-葡萄糖做驢精液基礎(chǔ)稀釋液的人工授精效果要明顯好于乳糖-卵黃基礎(chǔ)稀釋液。Marianne等［4］將經(jīng)超高溫處理奶稀釋，且在4℃保存不超過8 h的驢精液（有效精子200×106，10 mL）人工授精至發(fā)情母馬和母驢，發(fā)現(xiàn)母馬和母驢的情期受胎率均為45%，沒有明顯差異（P＞0.05）。同時(shí)，他們對驢精液進(jìn)行了更為深入的研究，試驗(yàn)分別將3種不同方式［處理Ⅰ用35℃奶稀釋精液；處理Ⅱ先用35℃奶稀釋，然后離心去除上清液，再加入22℃奶重新懸浮精子，并將精液保存在4℃的環(huán)境中；處理Ⅲ與Ⅱ組類似，但稀釋液為E1稀釋液（INRA82=1/2超高溫處理奶和1/2含有糖和鹽的溶液）］處理的精液分別人工授精至試驗(yàn)?zāi)阁H（有效精子 400×106，10 mL），Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的情期受胎率分別為86%、78%、63%，表明Ⅰ組和Ⅱ組的處理方式明顯優(yōu)于Ⅲ組。Oliveira等［5］用脫脂奶為基礎(chǔ)的BotuSemen稀釋液稀釋驢新鮮精液，然后給馬和驢進(jìn)行人工授精，發(fā)現(xiàn)輸入的有效精子為500×106（15 mL）時(shí)，情期受胎率在馬和驢分別為 93%（14/15）和 40%（6/15）。張瑞濤等［6］用加有20%卵黃的Tris-檸檬酸-葡萄糖稀釋液低溫保存24～48h的驢精液（試驗(yàn)組）以及單純用Tris-檸檬酸-葡萄糖稀釋液稀釋的新鮮精液（對照組）對母驢進(jìn)行了輸精試驗(yàn)，結(jié)果表明，試驗(yàn)組和對照組的受胎率分別為29.7%（27/91）和 35.2%（109/309）。何良軍等［7］則用檸檬酸鈉-葡萄糖稀釋液稀釋驢精液，并在低溫保存至第2天，精子活力在0.7以上時(shí)才用于輸精，結(jié)果在3月份輸精2頭，懷孕1頭，6月份輸精4頭，懷孕3頭。

1.2 卵黃

Jasko等［8］在以奶為基礎(chǔ)的稀釋液中添加4%、8%和16%的卵黃，發(fā)現(xiàn)能夠提高去除精漿的馬精子存活率和向前運(yùn)動(dòng)精子的活率。Bedford等［9］在以奶為基礎(chǔ)的稀釋液中添加4%的卵黃，發(fā)現(xiàn)有利于維持體外低溫保存馬精子的存活率；同時(shí)他們也發(fā)現(xiàn)，在以奶為基礎(chǔ)的稀釋液中添加卵黃后，馬精子的受精能力出現(xiàn)了明顯的下降，添加4%卵黃組的胚胎回收率為17%，而不添加組的則為50%。Jepsen等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍稀釋液中添加高濃度的卵黃對馬人工授精的受胎率有負(fù)面影響，甘油作為防凍劑且冷凍稀釋液中的卵黃濃度為20%時(shí)，馬的受胎率為0%；當(dāng)用乙二醇代替甘油，卵黃濃度仍然是20%時(shí)，馬的受胎率則為6.3%；當(dāng)卵黃濃度降為5%時(shí)，馬的受胎率則會(huì)提高到46.5%，因此可以看出，低的受胎率不僅與甘油的應(yīng)用有關(guān)，而且與卵黃的高濃度有關(guān)。Jepsen等［10］的另一項(xiàng)研究結(jié)果表明，β-環(huán)糊精能夠中和卵黃的這種損害受胎率的作用，在冷凍稀釋液中添加β-環(huán)糊精后可使馬的受胎率提高到58.3%，由于β-環(huán)糊精能與脂類和膽固醇結(jié)合，因此認(rèn)為卵黃中的膽固醇可能就是引起馬受胎率下降的物質(zhì)。Parks等［11］的研究結(jié)果表明，高膽固醇對精子細(xì)胞是有害的，它既可引起人精子和馬精子的不育［12-13］，又可能會(huì)使精子去能，抑制頂體反應(yīng)［14］。

1.3 精漿

在精液冷凍過程中，通常會(huì)離心去除精漿，然后再加入含有卵黃的抗凍稀釋液進(jìn)行冷凍保存，因此冷凍精液會(huì)缺乏精漿。Rota等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在解凍后的驢精液中加入精漿能提高母驢的受胎率。至于精漿的作用，Miró等［16］研究發(fā)現(xiàn)，精漿能夠降低因精液進(jìn)入子宮引起的中性粒細(xì)胞性炎性反應(yīng)。Oliveira等［5］則認(rèn)為，精漿中的蛋白可能會(huì)與卵黃中的膽固醇結(jié)合，從而可中和膽固醇的不良作用。也有大量在馬［17-20］和牛［21］中的研究結(jié)果表明，精漿能夠抑制多形核中性粒細(xì)胞的趨化和吞噬以及溶血性補(bǔ)體的活性；精漿蛋白可去除牛精子質(zhì)膜上的膽固醇，激發(fā)精子獲能；精漿分泌蛋白3有利于雌性生殖道內(nèi)精子的清除，對馬的生殖能力有促進(jìn)作用。然而與此不同的是，Parks等［11］的研究則認(rèn)為，解凍后的精液中加入精漿并不能提高冷凍保存驢精液的受孕率。

2 輸精時(shí)間對受胎率的影響

由于驢的情期持續(xù)時(shí)間長，排卵受個(gè)體、品種、年齡、營養(yǎng)水平、季節(jié)、氣候條件等的影響較大，排卵多在夜間，以及排出卵子維持受精能力的時(shí)間很短，因此很難確定發(fā)情母驢的排卵時(shí)間和適配時(shí)間。傳統(tǒng)的配種方法是在發(fā)情開始后的3～4 d開始，隔天本交一次，直至發(fā)情結(jié)束。這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，浪費(fèi)種公驢的精液和精力，嚴(yán)重阻礙優(yōu)良品種的推廣應(yīng)用。隨著卵巢卵泡直腸檢查技術(shù)的應(yīng)用，輸精時(shí)間的確定確實(shí)有了很大的改善，但這一技術(shù)很難掌握，需要很長時(shí)間實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的積累。近些年來，卵泡發(fā)育和排卵的B超檢測技術(shù)的應(yīng)用為這一問題的解決帶來一些曙光。

Saragusty等［22］用驢的冷凍精液給20頭發(fā)情母驢進(jìn)行了人工授精，結(jié)果表明，母驢的總受胎率50%（10/20），其受胎率與卵泡的直徑有密切關(guān)系，卵泡直徑在33.1～37.4 mm時(shí)受胎率90%（9/10），卵泡直徑小于33.1 mm時(shí)受胎率0%，卵泡直徑大于37.4 mm時(shí)僅1頭驢懷孕。馮玉龍等［23］也根據(jù)卵泡的檢測情況對驢進(jìn)行了人工授精試驗(yàn)，且在驢的發(fā)情期每12小時(shí)用B超檢查1次卵泡，排卵前每2小時(shí)檢查1次，試驗(yàn)組母驢在即將發(fā)生排卵時(shí)（大而不規(guī)則）進(jìn)行人工授精；對照組則在卵泡發(fā)育到直徑大于35 mm時(shí)進(jìn)行人工授精，并在排卵后再授精1次。結(jié)果表明，試驗(yàn)組驢的情期受胎率85%（17/20），而對照組64.6%。

從現(xiàn)有的研究資料來看，多數(shù)人在監(jiān)測卵泡發(fā)育情況時(shí)只注重卵泡的直徑，對卵泡的形狀、卵泡壁的薄厚和腫脹情況未給以足夠的重視，造成卵泡發(fā)育檢測對排卵和適配時(shí)間確定的指導(dǎo)意義不夠理想。可以想象的是不管卵泡有多大，若要排卵，卵泡壁就會(huì)變薄變軟，并因水腫而出現(xiàn)反光強(qiáng)度的下降，就會(huì)引起卵泡形狀的改變，卵泡會(huì)變成橢圓形、卵圓形和梨形等，特別在直腸探頭按壓時(shí)。這里并不是說卵泡的直徑大小不重要，而是就排卵的指導(dǎo)意義來講，卵泡的形狀和卵泡壁的狀況可能更重要。

近年來，人們還對誘導(dǎo)排卵情況下人工授精的懷孕情況進(jìn)行了探索。Rota等［15］在卵泡發(fā)育到直徑為32 mm時(shí)，用2 000 IU的人絨毛膜促性腺激素（hCG）（靜脈注射）、3.15 mg或6.3 mg的醋酸布舍瑞林（皮下注射）進(jìn)行誘導(dǎo)排卵，然后在誘導(dǎo)排卵注射后的16 h（hCG）或18 h（醋酸布舍瑞林）進(jìn)行人工輸精，若在22～24 h時(shí)仍未排卵，則在36～38 h時(shí)再輸精1次。在用甘油作為抗凍劑，并在解凍后用精漿進(jìn)行重新稀釋精液的情況下，獲得61.5%的凍精情期受胎率。Oliveira等［5］則在卵泡發(fā)育至直徑為33～35 mm時(shí)，肌注1 mg醋酸德舍瑞林進(jìn)行誘導(dǎo)排卵，注射后24 h開始輸精，并每8小時(shí)輸精1次，直至排卵，結(jié)果子宮角深部輸入凍精的受胎率為28.26%。

3 精液類型對受胎率的影響

用于驢人工授精的精液有鮮精、低溫保存精液（4℃）和凍精，從現(xiàn)有的研究結(jié)果來看，人工授精的情期受胎率基本上都是鮮精＞低溫保存精液＞凍精。Rossi等［2］用脫脂奶粉-葡萄糖稀釋液稀釋鮮精，馬上輸精和5℃保存12 h后輸精的情期受胎率分別為64.52%和50.72%。張瑞濤等［6］用Tris-檸檬酸-葡萄糖-卵黃稀釋液稀釋精液，人工授精后鮮精的情期受胎率為35.2%，4℃保存24～72 h后的情期受胎率為29.7%。Vidament等［4］將用奶稀釋的鮮精在4℃條件下保存（不超過8 h），情期輸精后母驢受胎率為45%（9/20），而用含有2.2%甘油的E2稀釋液稀釋冷凍的精液，輸精后的情期受胎率則只有 11%（4/38）。楊莉等［24］也對冷凍精液、低溫保存精液和鮮精的受孕情況進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，母驢情期受胎率分別為23.88%、29.67%、35.28%。

4 輸精量和有效精子數(shù)對受胎率的影響

對于輸精量的多少，不同的研究其報(bào)道的量也是不同的，少的只有 4 mL［4］，多的則達(dá) 22 mL［3］。由于人工輸精后母驢多會(huì)出現(xiàn)排尿，因此，在輸精管殘留可以忽略不計(jì)的情況下，輸精量應(yīng)該越少越好，這樣就可以減少輸精后排尿造成的精液倒流。若輸精管較粗，輸精后精液在輸精管內(nèi)殘留較多，則輸精量不可過少。至于合適的輸精量，還沒有見到相關(guān)的研究報(bào)道，還需依據(jù)所用的輸精管來確定。

至于輸入的有效精子數(shù)，不同的報(bào)道差異也很大，總的來說范圍在3×108～10×108之間?？梢韵胂蟮氖?，輸入母驢子宮內(nèi)的有效精子數(shù)越多，母驢的受孕機(jī)會(huì)就會(huì)越大。2016年，Oliveira等［5］用鮮精就有效精子數(shù)對母驢情期受胎率的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在宮體內(nèi)輸精的情況下，輸入的有效精子數(shù)為5×108時(shí)受胎率為40%，當(dāng)有效精子數(shù)增加到10×108時(shí)，受胎率則提高到73%。

5 輸精次數(shù)和間隔時(shí)間對受胎率的影響

由于驢卵子和精子維持受精能力的時(shí)間還不明確，致使輸精的次數(shù)和間隔時(shí)間也各不相同。一般情況下，當(dāng)卵泡直徑達(dá)到30～35 mm時(shí)開始輸精，間隔時(shí)間有的為 24 h［4，7］，有的為 48 h［3］；有的只在排卵前輸精［4-7，24］，有的則在排卵前和排卵后均輸精［1，22］。由于輸精開始的時(shí)間、間隔的時(shí)間以及停止的時(shí)間不同，自然輸精的次數(shù)也就各不相同。

從驢人工授精的研究結(jié)果來看，驢精子維持受精能力的時(shí)間相對較長，新鮮精液的精子維持受精能力的時(shí)間可能達(dá)到3～5 d［25］，但低溫保存精液和凍精能不能達(dá)到還值得懷疑，需要進(jìn)一步的研究。從其他動(dòng)物的經(jīng)驗(yàn)看，凍精維持受精能力的時(shí)間和存活時(shí)間都較鮮精有明顯的縮短。至于驢卵子維持受精能力的時(shí)間，易理輝等［26］認(rèn)為較馬更短，他們從實(shí)踐中得到的經(jīng)驗(yàn)是驢的輸精需要在排卵前進(jìn)行，排卵后輸精一般無效。馬卵子維持受精能力的時(shí)間一般不會(huì)超過 12～15 h，多數(shù)只有 2～6 h［25］，相信驢的比這更短。

6 輸精部位對受胎率的影響

Oliveira 等［5］、楊莉等［24］進(jìn)行了輸精部位對驢受胎率的影響的研究，發(fā)現(xiàn)子宮角深部輸精的受胎率均比子宮體內(nèi)輸精顯著提高。Oliveira等［5］應(yīng)用凍精進(jìn)行了試驗(yàn)研究，結(jié)果子宮體內(nèi)輸精的情期受胎率為0%，子宮角深部輸精的受胎率則達(dá)28.26%。楊莉等［24］則采用鮮精進(jìn)行了試驗(yàn)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子宮體內(nèi)和子宮角深部輸精的情期受胎率分別為33.33%和45.16%。這些試驗(yàn)表明，精子距離受精部位越近，精卵結(jié)合越容易，受胎率越高。

除了直腸引導(dǎo)深部子宮角輸精（TRG）外，近年來還有人用內(nèi)窺鏡對深部子宮角輸精（HYS）進(jìn)行了研究。Lindsey 等［27］的研究發(fā)現(xiàn)，用 HYS（5/10，50%）比 TRG（0/10，0%）的受孕率高；而 Brinsko 等［28］、Lindsey 等［29］和Hayden等［30］的研究則顯示，HYS和TRG兩種授精方式的受孕率差異不顯著（P＞0.05）。

7 結(jié)語

驢的人工授精技術(shù)還不夠成熟，還需要在理論上和實(shí)踐中進(jìn)行進(jìn)一步的研究，特別是凍精的人工授精。但不管怎樣，從先前的研究可以看出，提高輸精時(shí)間的準(zhǔn)確性以及精卵相遇幾率的措施均能夠提高驢人工授精的受胎率。未來仍需要在排卵時(shí)間的精確確定、優(yōu)良稀釋液和子宮角深部輸精實(shí)用器具的開發(fā)以及成套技術(shù)體系的建立等方面進(jìn)行更加深入的研究。