中藥發(fā)育毒性研究進(jìn)展

唐欣，謝曉芳，饒朝龍，彭成

發(fā)育毒理學(xué)（developmental toxicology）是在實(shí)驗(yàn)畸胎學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的毒理學(xué)的一個(gè)分支學(xué)科，主要關(guān)注藥物的發(fā)育毒性（developmental toxicity）。發(fā)育毒性是指由影響正常生長、機(jī)體穩(wěn)態(tài)、發(fā)育、分化和/或行為的化學(xué)物質(zhì)或物理因素所造成的任何形態(tài)或功能改變[1]，包括了傳統(tǒng)“三致”毒性中的“致畸”作用和胚胎毒性。目前，外源化學(xué)物發(fā)育毒性的評(píng)價(jià)主要包括三個(gè)方面，即哺乳動(dòng)物發(fā)育毒性試驗(yàn)、人群流行病學(xué)調(diào)查和發(fā)育毒性替代試驗(yàn)[2]。其中，在實(shí)驗(yàn)室研究中主要開展整體動(dòng)物發(fā)育毒性試驗(yàn)和替代試驗(yàn)。中藥在中醫(yī)臨床實(shí)踐已有數(shù)千年的歷史，傳統(tǒng)上認(rèn)為中藥作用相對(duì)溫和，且按照理法方藥的原則進(jìn)行配伍，不良反應(yīng)較少，因此中藥在國內(nèi)外妊娠期婦女中的使用比較普遍。自20世紀(jì)五六十年代震驚世界的“反應(yīng)?！笔录?，人們對(duì)妊娠期間使用藥物的謹(jǐn)慎性明顯增加[3～5]。由于歷史條件的局限性，傳統(tǒng)醫(yī)藥著作對(duì)中藥妊娠禁忌的記載仍然來源于臨床使用經(jīng)驗(yàn)，缺乏嚴(yán)謹(jǐn)系統(tǒng)的研究[6]。隨著中藥劑型的增多及用法、用量發(fā)生變化，部分中藥經(jīng)提取精制后，有效成分及有毒成分相對(duì)云集，在療效提高的同時(shí)，可能會(huì)致使相對(duì)的毒性增強(qiáng)或產(chǎn)生新的毒性[7～9]。如何避免中藥的發(fā)育毒性和致畸作用，保證中藥在孕婦、妊娠和哺乳期女性中的安全、科學(xué)用藥，按照現(xiàn)代發(fā)育毒性的認(rèn)識(shí)和方法，開展中藥發(fā)育毒性研究是中醫(yī)藥現(xiàn)代化和中醫(yī)現(xiàn)代臨床的迫切需求。本文通過整理近年來的國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)藥物發(fā)育毒性的研究方法進(jìn)行疏理，并以之概述中藥發(fā)育毒性研究現(xiàn)狀。

1 發(fā)育毒性的研究方法

發(fā)育毒性的研究方法大體分為兩大類，即體內(nèi)生殖發(fā)育毒性試驗(yàn)和體外替代試驗(yàn)。此外，流行病學(xué)調(diào)查也是重要的化合物毒性評(píng)價(jià)手段。藥品注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)和我國新藥臨床前研究指南有關(guān)發(fā)育生育毒性試驗(yàn)的規(guī)定大體上一致,即在體內(nèi)發(fā)育毒性方面將之分為3階段試驗(yàn)：①生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)，又稱一般生殖毒性試驗(yàn)；②胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)，即致畸試驗(yàn)；③出生前后發(fā)育毒性試驗(yàn)，即圍生期毒性試驗(yàn)[10]。在體外替代實(shí)驗(yàn)方法中，20世紀(jì)90年代末，歐洲替代方法研究中心(ECVAM)推薦有效性較高的3個(gè)體外胚胎發(fā)育毒性篩選試驗(yàn)作為體外篩選的首選方法，即體外全胚胎培養(yǎng)(whole embryo culture，WEC)試驗(yàn)、胚胎細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)(embryonic cell micromass culture，MM)試驗(yàn)和胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)(embryonic stem cell test，EST)[11～13]。在研究技術(shù)上，熒光原位雜交技術(shù)、彗星試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核分析試驗(yàn)等常用檢測(cè)方法也可應(yīng)用于中藥胚胎毒性的相關(guān)研究中[6]。隨著模式動(dòng)物斑馬魚在現(xiàn)代生命科學(xué)研究中的應(yīng)用，近年來也被應(yīng)用于發(fā)育毒性研究。

2 中藥發(fā)育毒性認(rèn)識(shí)的演變

中藥發(fā)育毒性研究是中藥安全性研究的重要組成部分。與傳統(tǒng)中醫(yī)理論中妊娠禁忌不同,現(xiàn)代所說的中藥發(fā)育生殖毒性不僅包括藥物致流產(chǎn)、胎兒死亡,還包括藥物對(duì)受胎能力、生殖系統(tǒng)、胚胎發(fā)育及胎仔出生后發(fā)育的潛在不良影響,以及藥物誘導(dǎo)畸胎產(chǎn)生的可能性[3]。而胚胎毒性(Embryo toxicity)通常是指外源性因素對(duì)胚胎的選擇毒性作用，表現(xiàn)為妊娠著床前早期階段或著床后段胚胎的丟失，或出生前引發(fā)的在胎兒期觀察到任何毒性表現(xiàn)。胚胎毒性雖然是在宮內(nèi)引發(fā)的，但表現(xiàn)在出生前或出生后的發(fā)育過程中，主要包括妊娠卵枯萎、胎死宮內(nèi)、胎兒生長受限、功能缺陷和畸形等[3]?；沃皇桥咛ザ拘缘囊环N，從廣義上講，生殖毒性試驗(yàn)又將致畸試驗(yàn)包括在內(nèi)[7]。中藥胚胎毒性的研究在20世紀(jì)五六十年代除了文獻(xiàn)整理以外,實(shí)驗(yàn)室研究的重點(diǎn)在于妊娠禁忌藥是否存在,且大多局限于流產(chǎn)、墮胎等中斷妊娠效果[8]。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,隨著胚胎毒性的定義不斷變化和藥物毒性的中藥毒性研究的規(guī)范化，,中藥的胚胎毒性已不僅僅是指妊娠禁忌藥,同時(shí)還引申到生殖發(fā)育毒性和遺傳毒性[9]。

3 體內(nèi)發(fā)育毒性試驗(yàn)方法及中藥研究進(jìn)展

3.1 試驗(yàn)方法

體內(nèi)發(fā)育毒性試驗(yàn)分為Ⅲ段：生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)（Ⅰ段）、胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)（Ⅱ段）和出生前后發(fā)育毒性試驗(yàn)（Ⅲ段）。其中Ⅰ段試驗(yàn)于妊娠前和妊娠初期給藥,以檢測(cè)受試物對(duì)動(dòng)物的生育力及早期胚胎發(fā)育的影響。在Ⅰ段試驗(yàn)中,雄性動(dòng)物給藥4～10周，雌性給藥2周,雄性動(dòng)物給藥期應(yīng)持續(xù)整個(gè)交配期直至處死,雌性動(dòng)物至少應(yīng)持續(xù)至胚胎著床(妊娠第6～7天)。觀察動(dòng)物體征、體重、攝食量變化,檢查藥物是否對(duì)動(dòng)物的交配情況產(chǎn)生影響,尸檢過程中著重檢查動(dòng)物生殖器官的變化,并進(jìn)行精子活力和著床情況檢查。Ⅱ段試驗(yàn)于胎兒器官發(fā)生期給藥,以檢測(cè)受試物可能的胚胎毒性和致畸性。大鼠妊娠第6～15天給藥,家兔妊娠第6～18天給藥。觀察動(dòng)物體征、體重、攝食量變化,尸檢過程中著重檢查孕鼠受胎情況,測(cè)量胎仔體重和身長。Ⅲ段試驗(yàn)于圍產(chǎn)期和哺乳期給藥,以檢測(cè)受試物對(duì)分娩、哺乳以及胎兒晚期發(fā)育、出生后生長和發(fā)育的可能影響。動(dòng)物在妊娠第15天至離乳期間給藥。觀察動(dòng)物體征、體重、攝食量變化,觀察藥物對(duì)孕鼠分娩的影響并對(duì)子代動(dòng)物存活、生長發(fā)育和行為情況進(jìn)行觀察[5,14]。

3.2 研究進(jìn)展

周莉[15]分別以1，5，15 g·kg-1紅花如意丸灌胃著床至硬腭閉合期間的SD妊娠大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅花如意丸對(duì)孕鼠的妊娠結(jié)局(平均黃體數(shù)和死胎率等)和胎仔的外觀、內(nèi)臟和體格生長發(fā)育(窩均體重、身長、尾長和胎盤重)均未見明顯影響；但對(duì)母鼠有毒性，主要表現(xiàn)為5和15 g·kg-1組母鼠體重增長緩慢和宮外增重減少；對(duì)胚胎-胎仔發(fā)育毒性表現(xiàn)為15 g·kg-1組活胎率降低，吸收胎率增加，以及5和15 g·kg-1組胎仔胸骨節(jié)骨化點(diǎn)發(fā)育遲緩。岳蘋[16]以2.275 g·kg-1生半夏湯及5.688 g·kg-1干姜人參半夏湯灌胃未孕小鼠及致畸敏感期孕鼠，結(jié)果未孕小鼠給藥14 d后和致畸敏感期孕鼠給藥10 d，均未出現(xiàn)異常。宋翼升[17]對(duì)孕6～15天SD大鼠灌胃云南白藥連續(xù)10天，劑量為4，1.4，0.5 g·kg-1，結(jié)果云南白藥可導(dǎo)致一定母體毒性，高劑量組大鼠給藥后出現(xiàn)流涎、活動(dòng)減少，部分打嗝、打噴嚏、撓嘴、呼吸音加粗，但上述異常可逆。周國亮[18]以相同劑量的云南白藥灌胃大鼠，從交配前到交配期直至胚胎著床期間均給藥，結(jié)果各劑量組雄鼠體重增長緩慢，有劑量和時(shí)間關(guān)系，且高、中、低劑量組睪丸系數(shù)及高劑量組的附睪系數(shù)、前列腺系數(shù)均顯著升高，表明云南白藥有一定親代毒性；但各劑量組交配率、妊娠率、合籠天數(shù)、子宮連胎重、黃體數(shù)、著床數(shù)、著床前丟失數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)等胚胎形成指標(biāo)與陰性對(duì)照組比較均無顯著性差異，表明對(duì)大鼠生育力和早期胚胎發(fā)育無影響。陳蓉芳[19]以10，30，90 mg·kg-1劑量于妊娠胎鼠器官形成期連續(xù)灌胃雷公藤提取物10天，在妊娠20天剖宮觀察，發(fā)現(xiàn)雷公藤提取物在90 mg·kg-1劑量時(shí)出現(xiàn)明顯的母體毒性和胚胎毒性,表現(xiàn)為母鼠體重增加值比對(duì)照組??；死胎率及吸收胎率增高,活胎率降低；30 mg·kg-1劑量時(shí)出現(xiàn)胎兒毒性，表現(xiàn)為胎兒體重、身長較小、胸骨缺失和骨化遲緩；未觀察到胎兒畸形。王海鳳[20]給妊娠第3天小鼠連續(xù)5天灌胃大黃水提取物7，5，2.5 g·kg-1，于孕第12天采血處死小鼠，結(jié)果隨著大黃水提取物劑量的增加，小鼠的流產(chǎn)率逐漸上升，7 g·kg-1處理組小鼠100%流產(chǎn)，檢測(cè)顯示血清雌激素和孕激素含量呈下降趨勢(shì)，細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2含量不同程度增加，同時(shí)肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加，結(jié)果表明大黃水提取物具有發(fā)育毒性。

4 體外替代試驗(yàn)方法及中藥研究進(jìn)展

4.1 體外全胚胎培養(yǎng)

體外全胚胎培養(yǎng)( whole embryo culture，WEC)是1934年Nicholas始創(chuàng)的實(shí)驗(yàn)方法，目前已成為研究各種藥物及化合物胚胎毒性和生殖毒性的經(jīng)典替代方法之一。1981年，Brown NA等利用大鼠體外胚胎培養(yǎng)手段制定了評(píng)價(jià)胚胎形態(tài)發(fā)育學(xué)和生長分化情況的評(píng)分系統(tǒng)，并以此作為評(píng)價(jià)胚胎發(fā)育和致畸性研究的一個(gè)指標(biāo)[21]。全胚胎培養(yǎng)技術(shù)是指將已在動(dòng)物體內(nèi)形成的胚胎取出后置于含有不同濃度藥物的體外培養(yǎng)液中，經(jīng)過一段時(shí)間的培育收獲胚胎，評(píng)估每個(gè)胚胎整體發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育情況，通過胚胎生長發(fā)育指標(biāo)和形態(tài)分化指標(biāo)等對(duì)藥物的胚胎發(fā)育毒性作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。肖凱[22]應(yīng)用大鼠著床后體外全胚胎培養(yǎng)模型，將9.5天SD大鼠胚胎與含生草烏終濃度分別為：0、0.63、1.25、2.5和5 mg生藥/mL的大鼠即刻離心血清共培養(yǎng)48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生草烏最大無作用劑量為1.25 mg·mL-1，且2.5 mg·mL-1以上劑量可誘發(fā)卵黃囊生長和血管分化不良、生長遲緩及形態(tài)分化異常，嚴(yán)重者出現(xiàn)體節(jié)紊亂、小頭、心臟發(fā)育遲滯(心小,停留在心管期)及心臟空泡等。表明較高劑量生草烏對(duì)體外培養(yǎng)大鼠胚胎具有一定的毒性作用,建議孕婦妊娠期間(特別是妊娠前3個(gè)月)慎用或禁用草烏。韓佳寅[23]采用小鼠全胚胎培養(yǎng)模型探討千里光的胚胎發(fā)育毒性，將8.5天小鼠胚胎從母體分離后,在含有千里光菲靈堿終濃度12.5，25，50和10 μg·mL-1和克氏千里光堿終濃度為12.5，25和50 μg·mL-1的血清中培養(yǎng)48 h，結(jié)果給藥后，VYS（臟層卵黃囊）直徑、顱臀長、頭長及體節(jié)數(shù)等胚胎生長發(fā)育指標(biāo)值和VYS循環(huán)、尿囊、翻轉(zhuǎn)、心、腦、尾神經(jīng)管、視聽嗅系統(tǒng)、腮弓、頜突及肢芽等胚胎器官形態(tài)分化指標(biāo)評(píng)分均較溶媒對(duì)照組有所降低，其毒性作用呈一定的量效關(guān)系，表明二者對(duì)離體胚胎的生長發(fā)育和形態(tài)分化均產(chǎn)生抑制。

4.2 胚胎細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)

胚胎細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)是20世紀(jì)80年代由Flint建立，并經(jīng)Renault等加以改善的體外培養(yǎng)試驗(yàn)系統(tǒng)，已廣泛應(yīng)用于胚胎毒物篩檢。其理論基礎(chǔ)在于一些毒性物質(zhì)影響靶器官或靶組織細(xì)胞的分化、增殖、遷移及基質(zhì)的改變，而這些改變可通過未分化細(xì)胞的體外培養(yǎng)表現(xiàn)出來，從而根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞集落形成數(shù)量、細(xì)胞形態(tài)、基質(zhì)變化和超微結(jié)構(gòu)的變化評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)的毒性作用及其機(jī)制。1991年Daston等[24]應(yīng)用雞胚神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞（CERC）進(jìn)行聚集物原代培養(yǎng)。目前為止，已建立雞、小鼠或大鼠肢芽細(xì)胞和中腦細(xì)胞等微團(tuán)培養(yǎng)方法用于發(fā)育毒性的研究。

WilkZasadna等[25]通過對(duì)大鼠中腦細(xì)胞微團(tuán)的培養(yǎng)研究赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）的毒性作用及機(jī)制。結(jié)果表明，OTA是一種強(qiáng)烈的致畸劑，其ID50＜10 mg·L-1，免疫評(píng)估顯示OTA對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的特殊選擇毒性；形態(tài)測(cè)量學(xué)評(píng)估通過計(jì)算機(jī)圖像分析，顯示致畸潛能與OTA影響神經(jīng)細(xì)胞的聚集有關(guān)。Tahereh TALAEI-KHOZANI等[26]觀察了夾竹桃提取物對(duì)小鼠肢芽軟骨形成和骨形成的影響，發(fā)現(xiàn)10 μg·mL-1的夾竹桃提取物能降低小鼠肢芽的軟骨形成，但對(duì)骨形成無影響，而更高濃度的夾竹桃提取物對(duì)小鼠肢芽的軟骨形成和骨形成卻均影響，原因不明。

4.3 胚胎干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(Embryonicstem cell test，EST)是1997年由Horst Spielmann最先發(fā)展起來的，自從1981年Evans等成功地從小鼠早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM）中分離出ESC以來[27～28]，研究者紛紛利用ESC的體外特性從細(xì)胞毒性、分化抑制和基因表達(dá)等不同水平評(píng)價(jià)藥物的潛在胚胎毒性和致畸性。可從ES細(xì)胞毒性、成纖維細(xì)胞毒性、抑制ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞等角度干細(xì)胞研究是目前國內(nèi)外生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)和前沿課題,利用胚胎干細(xì)胞建立發(fā)育毒物體外預(yù)測(cè)模型,可評(píng)價(jià)藥物的潛在胚胎毒性和致畸性[29]。目前干細(xì)胞在中藥研究的應(yīng)用主要集中在中藥對(duì)干細(xì)胞分化和增殖的影響作用方面,由于用胚胎細(xì)胞進(jìn)行毒理學(xué)研究可以克服傳統(tǒng)的體內(nèi)和體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)的不足,同時(shí)人類胚胎細(xì)胞的應(yīng)用,又可避免種屬差異,解決實(shí)驗(yàn)動(dòng)物結(jié)果向人外推的最大難題,因此將來源于人的胚胎干細(xì)胞引入中藥胚胎毒理學(xué)的研究,必將成為該領(lǐng)域重要的研究工具。

岳蘋[30]采用小鼠胚胎干細(xì)胞（mESC）觀察生半夏湯（粉）、干姜人參半夏湯（粉）的含藥血清的毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生半夏湯（粉）含藥血清可制體外mESC向心肌細(xì)胞的分化，干姜人參半夏湯（粉）含藥血清則無此作用。王鍵[31]通過研究中藥單體黃芩苷、葛根素和人參皂苷R1是否通過改變小鼠胚胎干細(xì)胞家族miR-290成員的表達(dá)影響D3系小鼠胚胎干細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果表明黃芩苷通過下調(diào)miR-294進(jìn)而抑制原癌基因c-jun和c-fos的表達(dá)從而抑制ESCs的增殖。

5 斑馬魚在中藥發(fā)育毒性研究中的應(yīng)用

斑馬魚（zebrafish，Daniorerio）作為一種模式動(dòng)物，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究。近些年，斑馬魚的研究已經(jīng)拓展和延伸到中藥領(lǐng)域。斑馬魚被稱為是21世紀(jì)新型毒性評(píng)價(jià)模型[32]，并得到國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Organization for Standardization，ISO）、經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）以及歐洲化妝品毒理學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)中心（European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals，ECETOC）等權(quán)威組織的認(rèn)可，被推薦為新的替代動(dòng)物[33]。作為一種整體動(dòng)物模型，斑馬魚能夠全面地檢測(cè)、評(píng)估中藥的活性和毒性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高通量篩選[34～38]。如許冰潔等[39]用斑馬魚胚胎評(píng)價(jià)5種已知對(duì)人類胚胎致畸藥物的毒性與安全性，證實(shí)斑馬魚胚胎模型可用于初步評(píng)價(jià)藥物的發(fā)育毒性和安全性。

國內(nèi)學(xué)者已開始利用斑馬魚評(píng)價(jià)中藥發(fā)育毒性。何育霖[40]將受精后0，10，24，48 h( hours post fertilization，hpf)發(fā)育正常的斑馬魚胚胎分別置于含有不同劑量紫草素的胚胎培養(yǎng)液中12，24，36，48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫草素在12 h內(nèi)引起斑馬魚的發(fā)育畸形，此外可引起斑馬魚幼魚心率減慢和抑制血管形成。何貝軒[41]用梯度濃度的木香揮發(fā)油處理2，12，24 hpf的斑馬魚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木香揮發(fā)油對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育有一定毒性，而且對(duì)發(fā)育期早期的毒性更大。

6 總結(jié)

隨著中藥廣泛應(yīng)用與臨床并發(fā)揮治療作用，其毒副作用和不良反應(yīng)也日益受到關(guān)注，其中生殖發(fā)育毒性備受關(guān)注。建立一個(gè)完善的中藥發(fā)育毒性評(píng)價(jià)體系,對(duì)古代醫(yī)家論述的妊娠禁忌藥重新評(píng)價(jià)和認(rèn)識(shí),對(duì)現(xiàn)代報(bào)道具胚胎毒性作用的中藥進(jìn)一步研究核實(shí),是一項(xiàng)刻不容緩的工作。我們也要認(rèn)識(shí)到實(shí)驗(yàn)結(jié)論是為人類健康服務(wù)的，鑒于其他種屬或離體組織與妊娠人體的差異，因而從人體得到的結(jié)論更有說服力。通過加強(qiáng)病例報(bào)告制度和大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)妊娠期使用中藥的結(jié)局進(jìn)行回顧性分析，都將有助于提高妊娠期使用中藥的安全性[42]。相信現(xiàn)代科技的迅猛發(fā)展將為中藥胚胎毒性的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化評(píng)價(jià)提供良好的實(shí)現(xiàn)條件,中藥胚胎毒性研究也有望借此得以新的突破。