HPLC法測(cè)定鹽酸氯卡色林原料藥中的有關(guān)物質(zhì)

陶俊鈺，劉為中，劉偉，何廣衛(wèi)，周潔（1.合肥市食品藥品檢驗(yàn)中心，合肥38000；.合肥醫(yī)工醫(yī)藥有限公司，合肥 30601）

鹽酸氯卡色林（Lorcaserin hydrochloride，Lorcaserin HCl），化學(xué)名為（R）-8-氯-1-甲基-2，3，4，5-四氫-1H-3-苯并氮雜卓鹽酸鹽半水合物[1-2]，是由Arena制藥公司研究開(kāi)發(fā)，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的新型減肥藥[3-5]。FDA于2012年6月27日批準(zhǔn)其上市。該藥可有效避免傳統(tǒng)減肥藥激動(dòng)5-HT2B受體引起的心臟瓣膜病變及肺動(dòng)脈高壓，為臨床治療肥胖癥提供了新的選擇[6-9]。

目前，已有文獻(xiàn)對(duì)鹽酸氯卡色林合成的工藝路線進(jìn)行了報(bào)道[10]，而對(duì)其原料藥的相關(guān)質(zhì)量研究并未見(jiàn)報(bào)道。鹽酸氯卡色林以N-（4-氯苯基乙基）-2-丙烯-1-胺鹽酸鹽為起始原料，在三氯化鋁催化下進(jìn)行分子內(nèi)環(huán)合、拆分、成鹽酸鹽后進(jìn)行水合物的制備而得。鑒于此，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立了測(cè)定鹽酸氯卡色林原料藥中有關(guān)物質(zhì)的方法，以期為完善該原料藥的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-15C型HPLC儀，包括SPD-M20A型紫外檢測(cè)器、LC solution Lite色譜工作站（日本Shimadzu公司）；XS105型十萬(wàn)分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；FE20型pH計(jì)（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水機(jī)（上海摩勒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸氯卡色林原料藥（合肥醫(yī)工醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：20140901、20140902、20140903）；雜質(zhì)1對(duì)照品（合肥伊博尼思化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)：20140810，純度：97%）；雜質(zhì)2對(duì)照品（合肥醫(yī)工醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：20140819，純度：98.9%）；雜質(zhì)3對(duì)照品（合肥醫(yī)工醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：20140829，純度：98.7%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch ultimate XB-ODS（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：磷酸二氫鈉溶液（取磷酸二氫鈉二水合物5.6 g，加水1 000 mL使溶解，再加三乙胺調(diào)pH為6.5，A）-乙腈（B）（梯度洗脫程序見(jiàn)表1）[11-13]；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別稱取雜質(zhì)1對(duì)照品18.90 mg、雜質(zhì)2對(duì)照品20.35 mg、雜質(zhì)3對(duì)照品24.81 mg，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得單一對(duì)照品貯備液。取上述單一對(duì)照品貯備液各1 mL，置于同一50 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，即得雜質(zhì)1質(zhì)量濃度為15.12 μg/mL、雜質(zhì)2質(zhì)量濃度為16.28 μg/mL、雜質(zhì)3質(zhì)量濃度為19.85 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品50.12 mg，置于100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，即得。

2.2.3 空白對(duì)照溶液 取流動(dòng)相作為空白對(duì)照溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取樣品50.34 mg，置于100 mL量瓶中，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下單一對(duì)照品貯備液各2 mL，加流動(dòng)相溶解并定容，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白對(duì)照溶液和系統(tǒng)適用性溶液各20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，各雜質(zhì)峰之間、主成分峰與雜質(zhì)峰之間均能達(dá)到基線分離，分離度均＞1.5；且保留時(shí)間適宜；其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of system suitability test

2.4 破壞性試驗(yàn)

2.4.1 光照破壞樣品溶液 取樣品10 mg，置于20 mL量瓶中加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，置于4 500 lx紫外燈下照射24 h，即得。

2.4.2 高溫破壞樣品溶液 取置于150℃烘箱中放置8 h后的樣品10 mg，置于20 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，即得。

2.4.3 酸破壞樣品溶液 取樣品100 mg，置于100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，取上述溶液5 mL，加1 mol/L鹽酸溶液2.0 mL，于80℃水浴放置6 h，加1 mol/L氫氧化鈉溶液2.0 mL中和，再加流動(dòng)相定容至10 mL，即得。

2.4.4 堿破壞樣品溶液 取樣品100 mg，置于100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，取上述溶液5 mL，加1 mol/L氫氧化鈉溶液2.0 mL，于80℃水浴放置6 h，加1 mol/L鹽酸溶液2.0 mL中和，再加流動(dòng)相定容至10 mL，即得。

2.4.5 氧化破壞樣品溶液 取樣品100 mg，置于100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，取上述溶液5 mL，加入30%過(guò)氧化氫溶液1 mL，搖勻，于50℃水浴放置10 min，再加流動(dòng)相定容至10 mL，即得。

取上述各樣品溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖2。由圖2可知，樣品在酸、堿、光照以及高溫條件下均較為穩(wěn)定，基本無(wú)降解產(chǎn)物產(chǎn)生，在氧化破壞條件下可產(chǎn)生兩個(gè)較為明顯的降解產(chǎn)物；但降解產(chǎn)物與主峰以及雜質(zhì)峰間均能達(dá)到基線分離。

2.5 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、1、1、1、1 mL，分別置于100、50、25、20、10 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液。取上述系列混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以雜質(zhì)1、2、3質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得雜質(zhì)1回歸方程為y＝3.342×104x－1 269（r＝0.999 9）、雜質(zhì)2回歸方程為y＝3.122×104x－322.4（r＝0.999 9）、雜質(zhì)3回歸方程為y＝3.267×104x－706.3（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，雜質(zhì)1、2、3檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.075 60～7.560、0.081 40～8.140 、0.099 24～9.924 μg/mL。

圖2 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of destructive test

2.6 定量限（LOQ）與檢測(cè)限（LOD）考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得LOD。結(jié)果，雜質(zhì)1、2、3的LOQ分別為0.075 60、0.081 40、0.099 25 μg/mL，LOD分別為0.022 68、0.024 42、0.029 77 μg/mL。

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)1、2、3峰面積的RSD分別為0.98%、1.02%、0.76%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20140901）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，只檢出雜質(zhì)1，其峰面積的RSD＝1.03%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20140901）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算有關(guān)物質(zhì)含量。結(jié)果，只檢出雜質(zhì)1，其含量的平均值為0.012%，RSD＝1.52%（n＝6），表明本試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.10 回收率試驗(yàn)

取低、中、高質(zhì)量的雜質(zhì)1、2、3對(duì)照品，分別置于100 mL量瓶中，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.11 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

取各批樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算有關(guān)物質(zhì)含量，結(jié)果見(jiàn)表3（表中“-”為未檢出）。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

筆者根據(jù)鹽酸氯卡色林的pKa值（pKa＝9.53），選用經(jīng)典的緩沖鹽體系（磷酸二氫鈉溶液）與有機(jī)相探索合理的配比，最終確定本試驗(yàn)的流動(dòng)相為磷酸二氫鈉溶液（取磷酸二氫鈉二水合物5.6 g，加水1 000 mL使溶解，再加三乙胺調(diào)pH為6.5）-乙腈。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在預(yù)試驗(yàn)中筆者進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)鹽酸氯卡色林原料藥的主成分在220 nm波長(zhǎng)處有較大吸收，起始原料、各中間體、終產(chǎn)品在220 nm波長(zhǎng)處摩爾吸收系數(shù)比接近1∶1，且其他波長(zhǎng)處均未檢測(cè)到較大雜質(zhì)。隨后筆者取“2.2.1”項(xiàng)下的單一對(duì)照品貯備液進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)1、2、3在220 nm波長(zhǎng)處均有較大吸收。因此，本試驗(yàn)最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

3.3 色譜系統(tǒng)耐用性考察

本試驗(yàn)分別考察了在柱溫變化（±5℃）、流速變化（±0.1 mL/min）、鹽濃度變化（±0.005 mol/L）、pH變化（±0.1）、有機(jī)相加入比例變化（±5%）以及不同批號(hào)色譜柱和不同儀器條件下樣品分離度及雜質(zhì)檢出個(gè)數(shù)，以對(duì)分析方法的耐用性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，在色譜條件發(fā)生微小變動(dòng)的條件下，雜質(zhì)種類、含量及分離度基本無(wú)變化，表明本方法耐用性良好。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2Results of recovery tests（n＝9）

表3 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）Tab 3 Results of related substance determination in samples（n＝3，%）

綜上所述，本方法靈敏、快速、準(zhǔn)確、可靠，可用于鹽酸氯卡色林原料藥中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

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