HPLC法同時(shí)測(cè)定腰痛膠囊中4種成分的含量Δ

羅春穎，黃曉婧，史立川，蒲旭峰#（.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都637；.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，成都 60000）

腰痛膠囊是由補(bǔ)骨脂、赤芍、肉桂等藥材組成的中藥成方制劑，具有補(bǔ)腎活血、強(qiáng)腰止痛的功效，臨床上主要用于治療腎虛腰痛、腰肌勞損等。該制劑收載于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)文號(hào)：YBZ06902006-2015Z），但僅以芍藥苷的含量作為其質(zhì)量控制指標(biāo)；且現(xiàn)有文獻(xiàn)多為研究測(cè)定腰痛片中相關(guān)成分含量測(cè)定的方法[1-4]，尚未有測(cè)定腰痛膠囊中多個(gè)成分含量的報(bào)道。鑒于此，本課題組參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-8]，采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時(shí)測(cè)定腰痛膠囊中赤芍的主要成分（芍藥苷）、肉桂的主要成分（桂皮醛）、補(bǔ)骨脂的主要成分（補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素）含量的方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters-2998型HPLC儀，包括二極管陣列檢測(cè)器、Empower pro自動(dòng)進(jìn)樣色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；AE240型電子分析天平（日本Shimadzu公司）；AE220型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；SK25OH型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；Milli-Q AdvantageA10型純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

腰痛膠囊（長(zhǎng)春海外制藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)：20160701、20161201、20170302，規(guī)格：0.3 g/粒）；芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201539，純度：96.4%）、桂皮醛對(duì)照品（批號(hào)：110710-201619，純度：99.4%）、補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（批號(hào)：110739-201416，純度：99.9%）、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（批號(hào)：110738-201614，純度：99.9%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0 min，10%B；0～15 min，10%→25%B；15～35 min，25%→32%B；35～40 min，32%→90%B）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm（芍藥苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素）、290 nm（桂皮醛）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取芍藥苷對(duì)照品5.22 mg、桂皮醛對(duì)照品30.82 mg、補(bǔ)骨脂素對(duì)照品6.56 mg、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品6.40 mg，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.100 6、0.612 7、0.131 0、0.127 8 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品內(nèi)容物1.2 g，研細(xì)，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加50%甲醇溶液適量，超聲（功率：250 W，頻率：53 kHz，下同）處理50 min，冷卻至室溫，再加50%甲醇溶液定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照品溶液 根據(jù)樣品的處方比例和制備工藝，分別制備缺補(bǔ)骨脂、赤芍和肉桂的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)均≥5 000。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量作為線性混合對(duì)照品溶液Ⅰ，再取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、0.8、0.6、0.4、1 mL，分別置于1、1、1、1、25 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得線性混合對(duì)照品溶液Ⅱ～Ⅵ。取上述線性混合對(duì)照品溶液Ⅰ～Ⅵ適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

2.5 定量限（LOD）與檢測(cè)限（LOQ）考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得LOD，結(jié)果見表2。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、桂皮醛、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD分別為1.40%、0.20%、0.50%、0.40%（n＝6），表明儀器精密度良好。

表2LOQ與LOD測(cè)定結(jié)果（ng）Tab 2 Determination results of LOQ and LOD（ng）

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20160701）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、桂皮醛、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD分別為0.80%、0.99%、0.39%、0.43%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20160701）內(nèi)容物粉末約1.2 g，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，芍藥苷、桂皮醛、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含量的平均值分別為2.678 0、0.470 8、0.223 0、0.216 0 mg/g，RSD分別為1.06%、1.37%、0.79%、1.14%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：20160701）約0.6 g，共6份，分別置于100 mL量瓶中，各加入一定質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 3Results of recovery tests（n＝6）

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 4 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本課題組采用二極管陣列檢測(cè)器在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)芍藥苷在232 nm波長(zhǎng)處、補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素在246 nm波長(zhǎng)處、桂皮醛在290 nm波長(zhǎng)處具有強(qiáng)吸收。綜合考慮，芍藥苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素在240 nm波長(zhǎng)處均有較大吸收，因此最終確定本試驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為240 nm（芍藥苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素）、290 nm（桂皮醛）。

3.2 提取溶劑的考察

本課題組考察了甲醇、50%甲醇溶液、乙醇、50%乙醇溶液對(duì)待測(cè)成分提取率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50%甲醇溶液作為提取溶劑時(shí)，芍藥苷、桂皮醛、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的總含量最大，因此選擇50%甲醇溶液為本試驗(yàn)的提取溶劑。

3.3 提取方法及時(shí)間的考察

本試驗(yàn)比較了回流法和超聲法對(duì)待測(cè)成分提取率的影響，結(jié)果上述兩種方法待測(cè)成分的提取率無(wú)明顯差異，綜合考慮超聲法操作簡(jiǎn)便，因此選擇超聲法為本試驗(yàn)的提取方法；進(jìn)一步考察超聲處理時(shí)間（30、40、50、60 min），結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲處理50 min時(shí)待測(cè)成分的含量最高，因此最終確定本試驗(yàn)的超聲處理時(shí)間為50 min。

3.4 流動(dòng)相及洗脫方式的考察

筆者考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液（13∶87，V/V）3種流動(dòng)相系統(tǒng)在等度洗脫與梯度洗脫條件下對(duì)本試驗(yàn)色譜的影響[4，9-15]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇-水和乙腈-0.1%磷酸溶液（13∶87，V/V）作為流動(dòng)相在等度和梯度洗脫條件下，芍藥苷及桂皮醛色譜峰峰形較差；以乙腈-水為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)，各色譜峰的分離度和峰型均良好且保留時(shí)間最為理想，因此確定本試驗(yàn)的流動(dòng)相為乙腈-水，洗脫方式為梯度洗脫。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于腰痛膠囊中芍藥苷、桂皮醛、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素含量的同時(shí)測(cè)定。

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