3株傳染性法氏囊病病毒的分離與鑒定

孟凱　袁小遠(yuǎn)　張玉霞　李莉　王友令

摘要：本研究于2014—2017年從山東省發(fā)生傳染性法氏囊病的雞群中分離到3株傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus， IBDV）毒株，通過(guò)RT-PCR技術(shù)對(duì)3株分離毒株進(jìn)行鑒定，并測(cè)定其ELD50以及對(duì)3周齡SPF雞的致死率。結(jié)果如下：3株傳染性法氏囊病病毒分離株均可導(dǎo)致70%以上SPF雞的死亡，屬于強(qiáng)毒株。通過(guò)特異性引物對(duì)3株分離株VP2基因的高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，序列分析結(jié)果顯示：3株分離株與5個(gè)超強(qiáng)毒株均在同一個(gè)大的分支上，同源性在96.3%～99.3%之間；與疫苗株B87和D78分屬于兩個(gè)分支，同源性僅為88.7%～90.6%。本研究為山東地區(qū)傳染性法氏囊病的防治提供了有益參考。

關(guān)鍵詞：傳染性法氏囊病病毒；分離與鑒定；RT-PCR；VP2

中圖分類號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2018）11-0129-04

Abstract Three infectious bursal disease virus （IBDVs） isolates were isolated from diseased chickens in Shandong Province in 2014-2017. These virus strains were detected by RT-PCR and inoculated into 3-week-old SPF chickens to determine their ELD50 and pathogenecity. The results showed that the mortality of the infected SPF chickens was equal to or greater than 70.0%，which indicated these isolates belonged to vvIBDV. The specific primers were used to amplify and sequence the high-varying regions of the VP2 gene of the three strains.The sequence analysis results showed that the three isolates were in the same big branch with other five vvIBDVs，and the homology was 96.3%～99.3%；the three isolates were classified into different branch from vaccine strains B87 and D78， and the homology was only 88.7%～90.6%. This study provided a useful reference for the prevention and treatment of IBDV in Shandong Province.

Keywords Infectious bursal disease virus （IBDV）； Isolation and identification； RT-PCR； VP2

雞傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease， IBD）是由傳染性法氏囊病病毒引起的一種主要危害雛雞的急性、高度接觸性傳染病，臨床上以雞的腹瀉和發(fā)熱為特征，該病毒主要侵害雞的法氏囊，導(dǎo)致雞體的免疫抑制及多種疫苗免疫的失敗，從而對(duì)養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)極大的危害[1]。Cosgrove[2]于1962年首次報(bào)道了雞傳染性法氏囊病，隨后幾十年內(nèi)，該病在世界范圍內(nèi)發(fā)生[3]。20世紀(jì)90年代初，我國(guó)北京、廣州和上海等地均報(bào)道過(guò)該病[4]。近30年來(lái)，隨著臨床上IBDV疫苗的普遍應(yīng)用，IBDV自身不斷發(fā)生變異，使IBDV的毒力增強(qiáng)。目前IBDV經(jīng)典毒株（cIBDV）、變異毒株和超強(qiáng)毒株（vvIBDV）在中國(guó)并存，經(jīng)常導(dǎo)致雞群的免疫失敗，給該病的防控帶來(lái)了更大的挑戰(zhàn)[5]。

傳染性法氏囊病病毒屬雙RNA病毒科（Birnaviridae）、雙RNA病毒屬（Birnavirus）成員，其基因組由A、B兩個(gè)片段組成，編碼VP1、VP2、VP3、VP4和VP5五種病毒蛋白，其中A片段編碼的VP2蛋白是IBDV的主要保護(hù)性抗原，為病毒的主要獨(dú)立因子，能夠誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞凋亡并產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體[6]。通過(guò)比對(duì)不同毒株的VP2氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)VP2蛋白在206～350位內(nèi)的氨基酸變化較大，稱為VP2高變區(qū)（vVP2），研究發(fā)現(xiàn)vVP2內(nèi)氨基酸的改變會(huì)導(dǎo)致IBDV毒力的改變[5]。本研究運(yùn)用RT-PCR技術(shù)對(duì)從山東省境內(nèi)發(fā)生IBD雞群中分離到的3株IBDV毒株的VP2基因進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序分析，從分子水平上探討山東省近期IBDV的流行情況，為山東地區(qū)該病的防治提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 毒株 3株IBDV分離株（SD-01、SD-02、SD-03），于2014—2017年分離自山東省不同地區(qū)傳染性法氏囊病發(fā)病雞場(chǎng)。

1.1.2 SPF雞胚及SPF雞 SPF雞胚及SPF雞均購(gòu)自山東SPF原種雞場(chǎng)。

1.1.3 試劑和儀器 DNA Marker （DL 2000 bp）、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol 總RNA提取試劑盒、SuperscriptTM RT-PCR Systems試劑盒、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒等，購(gòu)自寶生物（大連）公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病料采集與處理 病料采自山東省不同地區(qū)傳染性法氏囊病的發(fā)病雞場(chǎng)，無(wú)菌采取病變嚴(yán)重的病雞法氏囊組織，冷藏保存，帶回實(shí)驗(yàn)室。

將采集的病雞法氏囊組織融化后剪碎，放入研磨器中，加入3倍體積的滅菌磷酸鹽緩沖液（PBS）（1 g/mL，加入終濃度為1 mg/mL的青鏈霉素溶液）研磨，得到勻漿；加入等體積的氯仿，低溫?fù)u床振蕩24 h（220 r/min）； 4℃、10 000 r/min離心30 min，取上清。-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒分離與純化 將獲得的上清按0.2 mL/枚的量經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種于9 ～ 10日齡SPF雞胚，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將24 h內(nèi)死亡的胚棄去，收集3 ～ 5天死亡的雞胚，觀察雞胚死亡癥狀。無(wú)菌收集絨毛尿囊膜并觀察膜的病變情況，反復(fù)傳代至第3代，將絨毛尿囊膜作為試驗(yàn)用種毒。

1.2.3 病毒RNA的抽提 將收集的絨毛尿囊膜及病變明顯的胚體剪碎、研磨，加入5倍體積的無(wú)菌PBS制成懸液，反復(fù)凍融3次，4 000 r/min 離心10 min，取上清，按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)方法抽提病毒RNA。

1.2.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank上IBDV的VP2高變區(qū)基因序列，利用Primer 5.0軟件分析并設(shè)計(jì)引物。引物序列如下：上游引物（VP2-F）為5′-TGTAAAACGACGGCCAGTGCAT-3′；下游引物（VP2-R）為5′-TATGACCGAATTCGATCCTGTTGCCA-3′。引物由北京華大基因合成。預(yù)計(jì)擴(kuò)增條帶大小460 bp左右。

1.2.5 VP2基因擴(kuò)增 以M-MLV為反轉(zhuǎn)錄酶，參照說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模版擴(kuò)增VP2基因。PCR擴(kuò)增體系為：模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×buffer （QIANGEN） 25 μL，加入ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 50 s，72℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 3 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.2.6 VP2基因的克隆與測(cè)序 利用DNA膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物?；厥占兓筮B接pMD-18T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將生長(zhǎng)良好的菌落接種于LB培養(yǎng)基中，擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定。將篩選出來(lái)的陽(yáng)性重組質(zhì)粒交由Invitrogen（上海）公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.7 分離株VP2基因遺傳進(jìn)化分析 用MEGA 5.0軟件對(duì)測(cè)定的3株分離株VP2序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列與在GenBank上登錄的其他毒株的VP2序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。參考毒株及其GenBank登錄號(hào)如下：AH1（EU417823）、23-82（AF362773）、Harbin（AY321955）、B87（DQ202329）、BK912（AF416620）、BQ902（KT381974）、D78（AF499929）、OKYM（D49706）、GHUT-12（DQ778035）。

1.2.8 病毒雞胚半數(shù)致死量ELD50的測(cè)定 用滅菌的PBS將IBDV病毒液進(jìn)行10倍倍比稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5），每個(gè)稀釋度接種8枚9日齡SPF雞胚，接種量為每胚0.2 mL，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算分離病毒的ELD50。

1.2.9 病毒對(duì)SPF雞的致死率試驗(yàn) 將分離毒經(jīng)點(diǎn)眼、滴鼻途徑接種28日齡SPF雞10羽，每羽接種劑量為10ELD50/0.2mL，同時(shí)以健康SPF雞作為陰性對(duì)照，隔離飼養(yǎng)。攻毒后連續(xù)觀察兩周直至無(wú)死亡雞出現(xiàn)為止，記錄雞只死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離毒株VP2基因的凝膠電泳結(jié)果

取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示（毒株名稱略去），與預(yù)期結(jié)果相符。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL 2000 bp）；1：SD-01分離株；

2：SD-02分離株；3：SD-03分離株；4：陰性對(duì)照。

圖1 IBDV分離株P(guān)CR凝膠電泳圖

2.2 3株IBDV分離株VP2基因的氨基酸分析 根據(jù)其他學(xué)者的研究報(bào)告[7]，IBDV超強(qiáng)毒株的VP2高變區(qū)氨基酸殘基具有3個(gè)典型特征：（1）222、294位和299位分別為A、I和S三個(gè)特征性氨基酸；（2）249位和254位氨基酸分別為Q和G；（3）326 ～ 332位的保守七肽區(qū)為SWSGSAS，且279位和284位氨基酸分別是D和A，而非N和T，這是毒株具有高致病性的必要條件。對(duì)3株IBDV分離株的VP2高變區(qū)的氨基酸進(jìn)行分析，與超強(qiáng)毒株的特征性氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行比較（表1），發(fā)現(xiàn)3株IBDV分離株VP2高變區(qū)的氨基酸位點(diǎn)均符合超強(qiáng)毒株特征性氨基酸位點(diǎn)的特征。

2.3 分離株VP2基因遺傳進(jìn)化分析

從圖2中可以看出，3株分離株（SD-01、SD-02、SD-03）與IBDV超強(qiáng)毒株（AH1、OKYM、BQ902、GHUT-12、Harbin）在一個(gè)大的進(jìn)化樹(shù)分支上，同源性在96.3%～99.3%之間；與疫苗株B87和D78分屬于兩個(gè)分支，同源性在88.7%～90.6%之間。

2.4 病毒雞胚半數(shù)致死量ELD50及對(duì)SPF雞致死率測(cè)定結(jié)果

以絨毛尿囊膜途徑接種9日齡SPF雞胚，3株IBDV分離株均可在雞胚上復(fù)制，且均可使雞胚致死，雞胚出現(xiàn)的癥狀表現(xiàn)有出血、水腫、發(fā)育遲緩、肝臟腫大并伴隨出血、腎臟腫大并伴隨出血等。

3株IBDV分離株的ELD50存在一定程度差異（表2）。人工感染SPF雞后，雞只發(fā)病率達(dá)100%，出現(xiàn)羽毛蓬松、精神萎靡、食欲減退或廢絕、拉白綠色水樣糞便等表觀癥狀。對(duì)SPF雞的致死率均在70%及以上，剖檢發(fā)現(xiàn)雞的法氏囊腫大出血，有些甚至呈“紫葡萄”狀；胸肌、腿肌有片狀出血或出血性條紋。表明這3株分離株均為超強(qiáng)毒。

3 討論與結(jié)論

雞傳染性法氏囊病是一種重要的雞免疫抑制病[8]。IBDV是一種無(wú)囊膜、由A和B兩個(gè)節(jié)段構(gòu)成的RNA病毒，分為血清Ⅰ型和血清Ⅱ型，目前發(fā)現(xiàn)只有血清Ⅰ型對(duì)雞致病。根據(jù)病毒的毒力，通常把血清Ⅰ型IBDV分成超強(qiáng)毒株、經(jīng)典毒株和致弱毒株[9]。其中超強(qiáng)毒株對(duì)雞具有很高的感染率和致死率，由于超強(qiáng)毒株的抗原性與經(jīng)典毒株相比差異不大，常規(guī)的血清學(xué)診斷方法很難將二者區(qū)分，因此利用分子生物學(xué)方法對(duì)IBDV的分離株進(jìn)行分群具有非常重要的意義。

VP2蛋白由A節(jié)段131～1453位核苷酸編碼的441個(gè)氨基酸組成，VP2蛋白既是構(gòu)成病毒衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是一個(gè)變異性最大的蛋白，其206～350位氨基酸稱為高變區(qū)（vVP2），該區(qū)域內(nèi)任何氨基酸位點(diǎn)的改變都可能改變病毒的毒力，使病毒毒力增強(qiáng)從而突破IBDV疫苗的保護(hù)[10]。因此，對(duì)VP2基因高變區(qū)進(jìn)行研究不僅能發(fā)現(xiàn)IBDV的抗原性變化，也能提供毒株的遺傳進(jìn)化信息。

之前的研究曾經(jīng)把vVP2內(nèi)富含S的七肽區(qū)（SWSASGS）認(rèn)為是IBDV的毒力標(biāo)志。1996年Yamaguchi等[7]將IBDV超強(qiáng)毒OKYM株的266位氨基酸I突變成T后，發(fā)現(xiàn)病毒毒力變?nèi)?，從而開(kāi)啟了IBDV其他相關(guān)位點(diǎn)的研究工作。本試驗(yàn)利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增分離自山東省不同地區(qū)3株IBDV的vVP2，通過(guò)對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3株分離株的七肽區(qū)（SWSASGS）均與已知IBDV超強(qiáng)毒株的完全相同，通過(guò)從9個(gè)IBDV參考毒株的VP2基因高變區(qū)核苷酸序列所繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果來(lái)看，3株分離株與5個(gè)超強(qiáng)毒株均在同一個(gè)大的分支上，同源性在96.3% ～ 99.3%之間，并且3株分離株對(duì)SPF雞的感染率均達(dá)100%，死亡率均在70%以上，該結(jié)果與進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果一致，符合超強(qiáng)毒株的特性。說(shuō)明當(dāng)前在山東地區(qū)引起雞傳染性法氏囊病的流行毒株多為vvIBDV。近幾年疫苗免疫失敗的例子時(shí)有發(fā)生，除了人為免疫不合理以外，病毒變異和毒力增強(qiáng)也都有可能導(dǎo)致疫苗免疫失敗。本試驗(yàn)中分離到的3株分離株與2株經(jīng)典疫苗株分屬于不同的進(jìn)化分支上，同源性僅為88.7%～90.6%，因此經(jīng)典的Ⅰ型疫苗是否還能夠提供有效的保護(hù)還需作進(jìn)一步證實(shí)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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