蘿卜雄性不育研究進(jìn)展

王俊峰　蘭成云　孫楊　呂曉惠　朱嬌　馬蕾　韓偉

摘要：Ogura類型雄性不育是蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育研究最深入、最優(yōu)秀的材料。本文總結(jié)了Ogura雄性不育主控基因orf138在細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究進(jìn)展，闡述了Ogura類型雄性不育在蘿卜育種領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀，指明了orf138研究在今后蘿卜雜交育種研究中的方向和重要意義。

關(guān)鍵詞：蘿卜；Ogura雄性不育；orf138；雜交育種；

中圖分類號(hào)：S631.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2018）11-0159-04

Abstract Ogura type male sterility is the most in-depth and best material for the study of cytoplasmic male sterility in radish. In this paper，we summarized the research progress of Ogura male sterility master gene orf138 in cytology， genetics and molecular biology， elaborated the research status of Ogura cytoplasmic male sterility in radish breeding field， and pointed out the direction and significance of orf138 research in radish cross breeding in the future.

Keywords Raphanus sativus L.； Ogura male sterility； orf138； Hybrid breeding

蘿卜（Raphanus sativus L.）屬于十字花科蘿卜屬，是一種一年生或兩年生的重要蔬菜。蘿卜起源于我國(guó)，在長(zhǎng)期的栽培中，形成了豐富多樣的品種類型。蘿卜是異花授粉作物，具有顯著的雜種優(yōu)勢(shì)，但由于花器較小，人工去雄操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且一次授粉獲得的雜交種子很少，為解決這一問題，早期育種工作者選用自交不親和系育種。但自交不親和系易受環(huán)境等因素的影響，造成親和性不穩(wěn)定，經(jīng)常出現(xiàn)制種純度不高的現(xiàn)象。利用植物雄性不育系進(jìn)行雜交制種，可較好地解決自交不親和系制種的問題，提高雜交種子純度，增加農(nóng)作物產(chǎn)量，已成為國(guó)際種業(yè)育種的主要發(fā)展方向。

1 蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型及Ogura主控基因orf138的類型 蘿卜雄性不育的研究最早起源于日本。1968年小倉在日本的鹿兒島蘿卜中首先發(fā)現(xiàn)了Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育CMS（cytoplasmic male sterility），此后科技人員對(duì)Ogura雄性不育進(jìn)行了長(zhǎng)期深入的研究。我國(guó)對(duì)蘿卜雄性不育的選育及育種工作始于20世紀(jì)70年代初，山東[1]、遼寧、河南和山西[2]等地先后在蘿卜地方品種中發(fā)現(xiàn)了雄性不育材料，隨后相繼開展了蘿卜雄性不育育種工作，并在很短時(shí)間內(nèi)就育出了雜交種，并應(yīng)用于生產(chǎn)。后經(jīng)DNA測(cè)序比對(duì)分析，我國(guó)目前發(fā)現(xiàn)的蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料都屬于Ogura類型[3，4]。

細(xì)胞質(zhì)雄性不育是一種由細(xì)胞質(zhì)基因和細(xì)胞核基因共同互作形成的雄性不育現(xiàn)象[5]。蘿卜的細(xì)胞質(zhì)雄性不育一般有 Ogura-CMS （orf138）、Kos-CMS （orf125）[6]、DCGMS-CMS[7，8]和NWB-CMS[9]等類型，但最常見的還是Ogura不育類型。Ogura雄性不育不僅是迄今所知的所有蘿卜雄性不育類型中在導(dǎo)入率和穩(wěn)定性方面最優(yōu)秀的不育材料，同時(shí)也是研究最為深入的一種雄性不育材料。日本學(xué)者Yamagishi通過對(duì)蘿卜野生種、栽培種等不育材料進(jìn)行測(cè)序，將Ogura雄性不育基因orf138分為A到I九個(gè)類型[10]。據(jù)有關(guān)資料研究，雖然不同類型間堿基發(fā)生了變異，有的還導(dǎo)致氨基酸發(fā)生了變化，但A型與F型具有相同的恢復(fù)和保持關(guān)系[11，12，]，從目前已發(fā)現(xiàn)的不育材料看，能夠明確導(dǎo)致雄性不育的有A、B、D、F、H型，其它類型還有待驗(yàn)證。

2 orf138蛋白積累與育性的關(guān)系

大多數(shù)研究者認(rèn)為，Ogura類型雄性不育的主控基因?yàn)閛rf138 [13，14]。orf138基因存在于蘿卜線粒體基因組內(nèi)，其編碼的蛋白位于線粒體內(nèi)膜上[13，15]。orf138蛋白能夠顯著抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，據(jù)推測(cè)orf138基因能產(chǎn)生對(duì)花藥絨氈層線粒體活性具有一定毒性的蛋白[16]。細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因?qū)ǚ蹟∮臋C(jī)理已在水稻上有了一定研究進(jìn)展。Luo的課題組曾報(bào)道，在水稻線粒體中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)起源于野生稻的新基因WA352，它編碼的蛋白能夠與細(xì)胞核編碼的COX11蛋白發(fā)生互作。WA352積累優(yōu)先發(fā)生在花藥絨氈層，從而抑制COX11在過氧化物代謝中的功能，進(jìn)而引發(fā)絨氈層細(xì)胞的程序性死亡和花粉不育。而另外兩個(gè)育性恢復(fù)基因RF3和RF4的表達(dá)又能夠抑制WA352的表達(dá)，從而恢復(fù)水稻的育性。此外，在水稻野敗不育系和可育株系中還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)線粒體基因組單拷貝ATP合成酶基因apt6 和orfB[17]。而在蘿卜中發(fā)現(xiàn)，orf138與線粒體基因組中具有正常功能的orfB基因共轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生異常轉(zhuǎn)錄本和翻譯產(chǎn)物，從而在花藥發(fā)育的某個(gè)時(shí)期干擾線粒體的正常功能發(fā)揮，最終導(dǎo)致雄性不育現(xiàn)象的發(fā)生[15]。orfB與小麥、高粱和玉米中的atp8基因同源性分別為95%、96%和94%。這表明，orfB也是一種ATP合成酶基因。

盡管現(xiàn)在對(duì)雄性不育基因造成花粉敗育的機(jī)理還不明確，但是，無論是細(xì)胞質(zhì)不育還是細(xì)胞核不育，也不論是哪種作物，導(dǎo)致不育的原因主要指向花藥絨氈層的發(fā)育異常。絨氈層是花藥壁的最內(nèi)層，它包圍在生殖細(xì)胞周圍，為花粉發(fā)育提供養(yǎng)分，對(duì)花粉發(fā)育具有重要作用[18，19]。由于絨氈層對(duì)花粉發(fā)育的重要性，人們開始著重研究影響絨氈層發(fā)育的相關(guān)基因，并在對(duì)擬南芥雄性不育的研究中先后發(fā)現(xiàn)了ACOS5、A6、LTP12、LAP5、TSM1、TAP35、TAP44、A9等基因與絨氈層發(fā)育有關(guān)[20-22]。為了發(fā)現(xiàn)更多的與絨氈層發(fā)育相關(guān)的基因，Ma等[23]利用甘藍(lán)NiCMS和OguCMS細(xì)胞質(zhì)雄性不育、細(xì)胞核隱性雄性不育（RGMS）和顯性雄性不育（DGMS）4份材料進(jìn)行了花蕾的轉(zhuǎn)錄組研究，發(fā)現(xiàn)104個(gè)無花粉表達(dá)基因（non-pollen expressed genes，NPGs），這些基因絕大部分與絨氈層的發(fā)育有關(guān)，其中有22個(gè)基因之前已經(jīng)進(jìn)行了報(bào)道，并對(duì)5個(gè)基因進(jìn)行了原位雜交熒光定位。

近年也有人開始利用小RNA進(jìn)行雄性不育研究。Wei等對(duì)Ogura雄性不育大白菜的miRNA研究發(fā)現(xiàn)，有兩個(gè)新型的miRNAs在Ogura雄性不育型的花蕾中高表達(dá)，并抑制了兩個(gè)花粉發(fā)育關(guān)鍵基因SUC1和H+-ATPase6的表達(dá)[24]。這表明，在花蕾和花藥的發(fā)育過程中，可能存在這樣一個(gè)miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

3 orf138與恢復(fù)基因PPR-B的關(guān)系

蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育的育性可以通過恢復(fù)基因來恢復(fù)。1987年何啟偉利用不育系與恢復(fù)系雜交后代的分離情況推測(cè)，蘿卜Ogura類型的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系育性恢復(fù)基因由位于細(xì)胞核中的兩對(duì)顯性基因（MS1MS1MS2MS2）所控制，恢復(fù)系基因型為SMS1MS1MS2MS2或NMS1MS1MS2MS，不育系基因型為Sms1ms1ms2ms2，保持系基因型為Nms1ms1ms2ms2（S為不育型細(xì)胞質(zhì)，N為正常細(xì)胞質(zhì)）[1]。

研究表明，當(dāng)用恢復(fù)系與不育系進(jìn)行雜交時(shí)，恢復(fù)系中的恢復(fù)基因能夠產(chǎn)生一種PPR蛋白（pentatricopeptide repeat proteins）[11，12，25]，該蛋白能夠抑制orf138蛋白在花藥絨氈層的積累，從而達(dá)到育性恢復(fù)的目的。PPR是一種三角狀五肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域，具有該結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族是植物最大的蛋白家族之一。目前，PPR蛋白的結(jié)構(gòu)特征已經(jīng)基本清楚，其序列N端大都具有線粒體或葉綠體定位序列，其后為2～27個(gè)串聯(lián)重復(fù)的PPR結(jié)構(gòu)域，PPR結(jié)構(gòu)域之間通過形成具有結(jié)合溝的超螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合單鏈RNA，在線粒體和葉綠體基因轉(zhuǎn)錄后加工（包括編輯、剪接、剪切、降解和翻譯等）、調(diào)控細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因表達(dá)、參與調(diào)控胚胎形成和植物生長(zhǎng)發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用[26]。研究表明，目前蘿卜中已發(fā)現(xiàn)的與育性有關(guān)的PPR蛋白有三種——PPR-A、PPR-B 和PPR-C，但只有PPR-B在恢復(fù)油菜雄性不育育性中起作用[14]。PPR-B是一種可溶性的線粒體膜融合蛋白，能通過某種直接或者間接的方式抑制orf138的mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的翻譯，從而使雄性不育系恢復(fù)育性[27]。

4 展望

盡管蘿卜Ogura類型雄性不育的研究最早起源于1968年，但是近10年來，關(guān)于orf138的研究報(bào)道更多地集中在甘藍(lán)、大白菜、油菜等作物上[28-34]，在蘿卜上的相關(guān)研究報(bào)道并不多。且對(duì)于蘿卜Ogura類型雄性不育的研究也主要局限于orf138蛋白積累與育性的關(guān)系、orf138與恢復(fù)基因PPR-B的關(guān)系以及影響絨氈層發(fā)育的相關(guān)基因等，orf138在蘿卜雄性不育中的作用機(jī)制仍然比較模糊，沒有定論。未來通過對(duì)Ogura類型雄性不育材料的創(chuàng)新，將進(jìn)一步揭示orf138在蘿卜Ogura類型細(xì)胞質(zhì)雄性不育中的作用機(jī)制，為蘿卜雄性不育系的雜交育種提供明確的理論支持和技術(shù)指導(dǎo)，同時(shí)提供新的雄性不育類型，加快蘿卜育種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。通過對(duì)orf138的研究，可增強(qiáng)蘿卜及其它利用orf138雄性不育基因作物保持系選育的針對(duì)性，使新發(fā)現(xiàn)的雄性不育材料盡快應(yīng)用于生產(chǎn)，豐富蘿卜的雄性不育資源，避免細(xì)胞質(zhì)單一給生產(chǎn)帶來的潛在風(fēng)險(xiǎn)。新不育源的發(fā)現(xiàn)，可增加蘿卜保持系選育的成功率，這對(duì)今后的雜交育種具有重要意義。

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