ImageJ在骨細(xì)胞陷窩特性3D呈現(xiàn)中的應(yīng)用

王冰倩 呂正濤

[摘要] 骨細(xì)胞的三維（3D）形態(tài)可以順應(yīng)機(jī)械應(yīng)力發(fā)生改變，同時(shí)骨細(xì)胞陷窩形態(tài)的變化也可以影響骨細(xì)胞作為骨主要機(jī)械傳感器的功能。因此揭示皮質(zhì)骨中骨細(xì)胞陷窩的3D形態(tài)特征對(duì)于在細(xì)胞水平下更好地了解其機(jī)械性質(zhì)結(jié)構(gòu)是至關(guān)重要的。本文筆者基于實(shí)驗(yàn)室的儀器（3D X射線顯微鏡，MicroXCT-200）拍攝的100幅連續(xù)圖像，提出了一種高效的使用ImageJ軟件對(duì)骨細(xì)胞陷窩的3D特征進(jìn)行量化的圖像分析方法。通過(guò)對(duì)圖像序列的導(dǎo)入、閾值分割、降噪處理、反轉(zhuǎn)、填充以及邏輯運(yùn)算等處理步驟，最終得到感興趣區(qū)域內(nèi)骨細(xì)胞陷窩的數(shù)量、表面積、體積以及其他用于描繪骨細(xì)胞3D特征的指數(shù)。

[關(guān)鍵詞] ImageJ；骨細(xì)胞陷窩；3D形態(tài)；皮質(zhì)骨

[中圖分類號(hào)] R336 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）10（c）-0172-06

[Abstract] The three-dimensional （3D） morphology of osteocytes is assumed to adapt to physiological mechanical loading， the variation in the morphology of osteocyte lacunae is hypothesized to influence the function of osteocytes as the master mechanosensors of bone. Thus， to reveal the 3D characterization of osteocyte lacunae in cortical bone is essential for a better understanding of its structure in relation to its inferior mechanical properties in a cellular level. In this paper， the authors used a series of 100 consecutive images from laboratory-based instrumentation （3D X-ray microscope， MicroXCT-200） and proposed a computationally efficient image analysis method to quantify the 3D characterization of osteocyte lacunae using ImageJ software. The number of osteocyte lacunae （N.Lc）， surface area of osteocyte lacunae （Lc.SA）， volume of osteocyte lacunae （Lc.V） and other parameters used to describe 3D characterization of osteocyte lacunae within the region of interest could be accomplished after a series of operations including importing the image stack， thresholding and despeckling， inverting， filling holes and logical calculation.

[Key words] ImageJ； Osteocyte lacunae； 3D morphology； Cortical bone

骨細(xì)胞陷窩（osteocyte lacunae）在松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨組織中均大量存在，成年人類骨組織中估計(jì)有420億骨細(xì)胞陷窩[1]。正由于其數(shù)量龐大，輕微的數(shù)量上的變動(dòng)都可能使骨組織的機(jī)械特性產(chǎn)生極大的改變[2-7]。骨細(xì)胞陷窩數(shù)量減少會(huì)導(dǎo)致骨組織孔隙率降低，所以當(dāng)骨組織遭遇機(jī)械應(yīng)力時(shí)其吸收機(jī)械應(yīng)力的能力也會(huì)隨之下降，骨折風(fēng)險(xiǎn)隨之上升[8-12]。

由于骨細(xì)胞及其陷窩不像成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞那樣在骨的表面發(fā)揮生物學(xué)功能，骨細(xì)胞及陷窩是內(nèi)嵌在骨基質(zhì)當(dāng)中，所以迄今為止用來(lái)直接觀測(cè)骨細(xì)胞陷窩形態(tài)的方法并不多[4，13]。而且單個(gè)骨細(xì)胞陷窩體積很小，一小塊骨組織也包含成千上萬(wàn)的骨細(xì)胞陷窩，所以分析骨細(xì)胞的分布和形態(tài)不僅極其費(fèi)時(shí)，更多地也是停留在二維方法，比如共聚焦顯微鏡[14]、掃描電鏡[15]、透射電鏡等[16]。CT及μCT等三維掃描技術(shù)越來(lái)越多地被應(yīng)用在骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究中[17-19]，然而三維掃描之后的圖像序列通常大小超過(guò)1 GB，現(xiàn)存的用于三維重建的軟件比如Avizo、Amira等均需要購(gòu)買昂貴的證書，而且對(duì)于電腦中央處理器和顯卡要求很高，這極大提高了骨組織樣本分析的難度和成本。

ImageJ是由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）開發(fā)的一款基于Java語(yǔ)言平臺(tái)的免費(fèi)圖像處理軟件，大量的免費(fèi)插件也極大的拓寬了ImageJ的使用范圍。ImageJ在醫(yī)學(xué)影像診斷領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，而國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)存文獻(xiàn)中有關(guān)如何開發(fā)或使用ImageJ的資料相對(duì)匱乏，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道如何使用ImageJ軟件分析骨細(xì)胞陷窩形態(tài)的資料。因此本文旨在總結(jié)如何使用ImageJ對(duì)骨組織掃描的圖像序列進(jìn)行三維重建并分析骨細(xì)胞陷窩形態(tài)學(xué)特征，建立一種利用ImageJ分析骨細(xì)胞陷窩三維特征的流程框架，為將來(lái)研究骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)的研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 ImageJ下載及安裝

ImageJ軟件的下載地址為：https：//imagej.nih.gov/ij/download.html，對(duì)應(yīng)不同的系統(tǒng)平臺(tái)選擇不同的ImageJ安裝包進(jìn)行下載。截至2018年5月，最新的ImageJ版本為ImageJ 1.8.0版本。為了處理骨細(xì)胞陷窩特征數(shù)據(jù)還需要下載ImageJ的BoneJ插件[20]（http：//bonej.org/）。本文所使用的ImageJ軟件為基于Windows 10系統(tǒng)的1.8.0最新版本，BoneJ插件為1.4.2版本。

2 骨細(xì)胞陷窩特性的測(cè)量過(guò)程

2.1 導(dǎo)入圖像序列及圖像屬性設(shè)置

ImageJ軟件可以支持TIFF、PNG、BMP、DICOM、GIP、JEPG等多種圖片格式的輸入。在三維重建之前，首先需要在ImageJ導(dǎo)入一組圖像序列，使用File> Import> Image Sequence命令將100張連續(xù)的DICOM圖像序列導(dǎo)入ImageJ。本文使用的圖像序列為8周齡野生型雄性C57BL/6小鼠的脛骨骨干內(nèi)側(cè)皮質(zhì)經(jīng)過(guò)MicroXCT-200掃描得到的圖像序列，掃描位置詳見(jiàn)圖1a。成功導(dǎo)入圖像序列之后，根據(jù)掃描樣本的實(shí)際大小設(shè)置ImageJ中的圖像序列參數(shù)，以便后期進(jìn)行骨細(xì)胞陷窩體積大小篩選使用。使用Image> Properties命令，設(shè)置圖像序列的長(zhǎng)度單位以及像素長(zhǎng)度寬度等參數(shù)（圖1b），例如本文使用的圖像序列為100張連續(xù)的434.12 μm×445.61 μm大小的圖像。

2.2 閾值分割及降噪處理

閾值分割是利用灰度直方圖分析圖像序列的灰度分布，從而實(shí)現(xiàn)將圖像上的像素標(biāo)記為背景或?qū)ο?，從而?shí)現(xiàn)對(duì)圖像序列的二值化。使用Image> Adjust> Threshold命令，在閾值分割時(shí)使用ImageJ自帶的“Default”算法，點(diǎn)擊Apply以后將骨細(xì)胞陷窩標(biāo)記為白色，其余部分為黑色（圖2a）。此時(shí)圖像序列已轉(zhuǎn)化為二值化的圖像序列，但是圖像序列中可見(jiàn)有類似胡椒鹽形狀的背景噪聲，為了更好地呈現(xiàn)骨細(xì)胞陷窩形態(tài)并同時(shí)減少電腦的運(yùn)算負(fù)擔(dān)，需要將圖像序列進(jìn)行降噪處理。在ImageJ提供的多種過(guò)濾器中，可以選擇Median 3D或Mean 3D過(guò)濾器對(duì)圖像序列進(jìn)行降噪處理，Median 3D相比于Mean 3D對(duì)圖像邊緣的保留效果更好，使用Process > Filters > Median 3D命令，得到降噪之后的圖像見(jiàn)圖2b。

2.3 反轉(zhuǎn)及填充

在閾值分割和降噪處理之后可以得到更加清晰的二值化圖像序列（圖2b），骨細(xì)胞陷窩標(biāo)記為白色，骨基質(zhì)為黑色，外周背景為白色。將圖像序列反轉(zhuǎn)之后得到骨細(xì)胞陷窩為黑色，骨基質(zhì)為白色，其余背景均為黑色（圖3a）。此時(shí)打開圖2b，使用Process> Binary> Fill Holes命令，將圖2b中的骨細(xì)胞陷窩填充成黑色從而得到圖3b。此時(shí)將圖2b進(jìn)行填充的目的是為了進(jìn)行下一步的邏輯運(yùn)算，以便得到骨細(xì)胞陷窩的圖像序列。

2.4 邏輯運(yùn)算及感興趣區(qū)域的創(chuàng)建

為了得到骨細(xì)胞陷窩，筆者在這里使用ImageJ提供的“AND”邏輯運(yùn)算功能。由于圖3a骨細(xì)胞陷窩為黑色，骨基質(zhì)為白色；而圖3b骨基質(zhì)及骨細(xì)胞陷窩均為黑色，所以AND運(yùn)算之后僅骨細(xì)胞陷窩以及之前存留的背景噪聲會(huì)存留下來(lái)（圖4a）。ImageJ軟件提供了強(qiáng)大的感興趣區(qū)域（region of interest，ROI）的選擇功能，在此不做贅述。由于圖像序列中有一部分并非骨皮質(zhì)部分，筆者利用圓形選擇工具在圖4a的骨皮質(zhì)范圍內(nèi)選擇直徑為300.30 μm的圓形為ROI，去除圓圈以外的圖像得到圖4b。此時(shí)的圖4b所在區(qū)域詳見(jiàn)圖1a。

2.5 分析骨細(xì)胞陷窩特性

分析骨細(xì)胞陷窩的特性還需要ImageJ中的Particle Analyser插件。在打開圖4b之后，使用Plugins>Analyze > Particle Analyser命令進(jìn)行分析，此時(shí)可以看到如圖5的設(shè)置頁(yè)面，其中包括測(cè)量選項(xiàng)（Measurement Options）以及圖像結(jié)果顯示選項(xiàng)（Graphical Results）。在測(cè)量選項(xiàng)中如果選擇了“Exclude on sides”選項(xiàng)則表示圖像序列邊緣的粒子不會(huì)被計(jì)入統(tǒng)計(jì)，為了避免破碎的骨細(xì)胞陷窩干擾最終的統(tǒng)計(jì)結(jié)果筆者在統(tǒng)計(jì)骨細(xì)胞陷窩特征時(shí)可以排除邊緣的骨細(xì)胞；其他的測(cè)量選項(xiàng)還包括是否測(cè)量骨細(xì)胞陷窩的表面積（Surface Area）、體積（Enclosed Volume）、Euler特征（Euler Characteristic）、慣性矩（Moments of Inertia）等信息，選擇的選項(xiàng)越多，電腦的運(yùn)算負(fù)擔(dān)也會(huì)越重，得到結(jié)果的速度就越慢；“Min Volume”和“Max Volume”選項(xiàng)是Particle Analyser的重要過(guò)濾器，可以通過(guò)限制粒子的體積來(lái)過(guò)濾圖像中的背景噪聲，或者是體積過(guò)大的血管結(jié)構(gòu)等。

由于在圖1b中筆者已經(jīng)設(shè)置了圖像序列的真實(shí)大小，此時(shí)根據(jù)客觀骨細(xì)胞大小，將Min Volume設(shè)置為50 μm3而Max Volume設(shè)置為1500 μm3，可以得到體積范圍在50～1500 μm3的骨細(xì)胞陷窩[21]。體積小于50 μm3被認(rèn)為是背景噪聲或偽影，而體積大于1500 μm3被認(rèn)為是骨基質(zhì)中的血管或者哈佛管。在圖像結(jié)果顯示中，凡是標(biāo)記了3D顯示的結(jié)果，均會(huì)在ImageJ的ImageJ D Viewer中顯示。而數(shù)字統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖6。常見(jiàn)的用于描述骨細(xì)胞陷窩大小的指標(biāo)有骨細(xì)胞陷窩數(shù)量（N.Lc）、總的骨細(xì)胞陷窩體積（Lc.V，μm3）、平均骨細(xì)胞陷窩體積（=Lc.V/N.Lc，μm3）、骨細(xì)胞陷窩表面積（Lc.SA，μm2）。而描述骨細(xì)胞陷窩形狀的指標(biāo)有骨細(xì)胞陷窩等徑指數(shù)（Lc.Eq=minor radius/major radius）、骨細(xì)胞陷窩延伸指數(shù)（Lc.El=1-int. radius/major radius）、骨細(xì)胞陷窩扁平指數(shù)（Lc.Fl=1-minor radius/int. radius）、骨細(xì)胞陷窩球形指數(shù)[SphR=（3.142）1/3（6Lc.V）2/3/Lc.SA]等。根據(jù)圖6得到的數(shù)據(jù)表，讀者可以利用Excel或者其他數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行計(jì)算。

2.6 圖像的3D呈現(xiàn)

除了得到數(shù)字運(yùn)算的結(jié)果，ImageJ還具有骨細(xì)胞陷窩3D呈現(xiàn)的功能，以便更好地了解骨細(xì)胞陷窩的大小及分布情況。筆者以體積呈現(xiàn)（Volume Rendering）為例：打開圖6之后，使用Plugins>3D>Volume Viewer命令，會(huì)打開一個(gè)新的Volume Viewer 2.0操作界面，如圖7所示。圖7中央顯示的是100張連續(xù)圖像序列中，被選中的感興趣區(qū)域里，體積體積范圍在50～1500 μm3的121個(gè)骨細(xì)胞陷窩的體積呈現(xiàn)。使用鼠標(biāo)可以對(duì)圖像序列的邊框進(jìn)行拖動(dòng)，得到更好的體積呈現(xiàn)效果。

3 小結(jié)

ImageJ是NIH開發(fā)的基于Java語(yǔ)言的一款公用多維圖像處理工具及分析平臺(tái)，可運(yùn)行于Microsoft Windows、Mac OS、Mac OS X、Linux和Sharp Zaurus PDA等多種平臺(tái)。其開放源代碼、免費(fèi)、支持多種插件應(yīng)用、兼容多格式圖像來(lái)源、處理速度快、占用內(nèi)存小、適用性強(qiáng)等特點(diǎn)，使其在影像學(xué)診斷、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究分析中應(yīng)用廣泛，但目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道如何使用ImageJ分析皮質(zhì)骨中骨細(xì)胞陷窩的3D形態(tài)特征。

使用ImageJ軟件圖像處理分析作為一種客觀的評(píng)價(jià)手段，通過(guò)設(shè)定若干參數(shù)，能直接得到準(zhǔn)確性高、重復(fù)性較好的數(shù)據(jù)，可幾乎不受主觀認(rèn)知和經(jīng)驗(yàn)等人為因素干擾。本研究使用ImageJ將野生型雄性C57BLI6小鼠脛骨經(jīng)過(guò)MicroXCT-200掃描得到的100張連續(xù)圖像序列進(jìn)行閾值分割、降噪處理、反轉(zhuǎn)、孔洞填充、邏輯運(yùn)算及劃定感興趣區(qū)域，逐步得到較準(zhǔn)確的骨細(xì)胞陷窩的圖像序列。進(jìn)一步使用ImageJ中Particle Analyser等插件，剔除圖像中背景噪聲、偽影等體積小于50 μm3的顆粒，以及體積大于1500 μm3的血管或者哈佛管，達(dá)到凈化目標(biāo)圖像的目的。同時(shí)可計(jì)算、統(tǒng)計(jì)得到多類描述骨細(xì)胞陷窩大小的指標(biāo)數(shù)值。為更好、更直接地呈現(xiàn)骨細(xì)胞陷窩的大小及分布情況，ImageJ可對(duì)骨細(xì)胞陷窩的3D形態(tài)特征進(jìn)行量化和呈現(xiàn)，得到實(shí)驗(yàn)者期望的呈現(xiàn)效果。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Buenzli PR，Sims NA. Quantifying the osteocyte network in the human skeleton [J]. Bone，2015，75：144-150.

[2] Yeni YN，Vashishth D，F(xiàn)yhrie DP. Estimation of bone matrix apparent stiffness variation caused by osteocyte lacunar size and density [J]. J Biomech Eng，2001，123（1）：10-17.

[3] Sano H，Kondo N，Endo N. Intravital bone imaging ～Osteocyte [J]. Clin Calcium，2018，28（2）：223-230.

[4] Liu Y，Chen B，Yin D. Effects of direction and shape of osteocyte lacunae on resisting impact and micro-damage of osteon [J]. J Mater Sci Mater Med，2017，28（3）：38.

[5] Bach-Gansmo FL，Bruel A，Jensen MV，et al. Osteocyte lacunar properties and cortical microstructure in human iliac crest as a function of age and sex [J]. Bone，2016， 91：11-19.

[6] van Oers RF，Wang H，Bacabac RG. Osteocyte shape and mechanical loading [J]. Curr Osteoporos Rep，2015，13（2）：61-66.

[7] Verbruggen SW，Vaughan TJ，McNamara LM. Mechanisms of osteocyte stimulation in osteoporosis [J]. J Mech Behav Biomed Mater，2016，62：158-168.

[8] Mullender MG，van der Meer DD，Huiskes R，et al. Osteocyte density changes in aging and osteoporosis [J]. Bone，1996，18（2）：109-113.

[9] Hemmatian H，Bakker AD，Klein-Nulend J，et al. Aging，Osteocytes，and Mechanotransduction [J]. Curr Osteoporos Rep，2017，15（5）：401-411.

[10] Main RP. Osteocytes and the bone lacunar-canalicular system： Insights into bone biology and skeletal function using bone tissue microstructure[J]. Inter J Paleopathol，2017，18：44-46.

[11] Nango N，Kubota S，Hasegawa T，et al. Osteocyte-directed bone demineralization along canaliculi [J]. Bone，2016，84：279-288.

[12] Chen H，Senda T，Kubo KY. The osteocyte plays multiple roles in bone remodeling and mineral homeostasis [J]. Med Mol Morphol，2015，48（2）：61-68.

[13] Matsuo K，Nango N. Osteocytic osteolysis：measurements of the volume of osteocytic lacunae [J]. Clin calcium，2012， 22（5）：677-683.

[14] McCreadie BR，Hollister SJ，Schaffler MB，et al. Osteocyte lacuna size and shape in women with and without osteoporotic fracture [J]. J Biomech，2004，37（4）：563-572.

[15] Boyde A，Jones SJ. Scanning electron microscopy of bone： instrument，specimen，and issues [J]. Microsc Res Tech，1996，33（2）：92-120.

[16] Rubin MA，Rubin J，Jasiuk I. SEM and TEM study of the hierarchical structure of C57BL/6J and C3H/HeJ mice trabecular bone [J]. Bone，2004，35（1）：11-20.

[17] Carter Y，Suchorab JL，Thomas CD，et al. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males [J]. J Anat，2014，225（3）：328-336.

[18] Carter Y，Thomas CD，Clement JG，et al. Variation in osteocyte lacunar morphology and density in the human femur--a synchrotron radiation micro-CT study [J]. Bone，2013，52（1）：126-132.

[19] Dong P，Haupert S，Hesse B，et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images [J]. Bone，2014，60：172-185.

[20] Doube M，Klosowski MM，Arganda-Carreras I，et al. BoneJ： Free and extensible bone image analysis in ImageJ [J]. Bone，2010，47（6）：1076-1079.

[21] Carriero A，Doube M，Vogt M，et al. Altered lacunar and vascular porosity in osteogenesis imperfecta mouse bone as revealed by synchrotron tomography contributes to bone fragility [J]. Bone，2014，61：116-124.

（收稿日期：2018-05-17 本文編輯：蘇 暢）