丙二醛的毒性作用及檢測技術(shù)研究進展

翟曉虎，楊海鋒，陳慧英，何衛(wèi)華，楊俊花*

（1江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州225300；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海201403；3江西工業(yè)貿(mào)易職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南昌330038）

丙二醛是生物體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的產(chǎn)物，為1，3-雙不飽和醛結(jié)構(gòu)，化學(xué)性質(zhì)活潑，具有親電子性。生物體內(nèi)，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為丙二醛，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細胞毒性。故在科學(xué)研究中常將MDA作為機體氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化的重要生理指標(biāo)。過量的MDA蓄積，不僅能降低動物體能、損傷神經(jīng)，還能破壞腸道細胞結(jié)構(gòu)，影響線粒體功能［1-3］。MDA作為飼料油脂氧化酸敗重要的有毒有害物質(zhì)之一，畜禽攝入后極易引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致組織細胞膜結(jié)構(gòu)受損、流動性下降，肝臟抗氧化能力降低，動物生產(chǎn)性能和肉品質(zhì)也下降，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失［4-5］。此外，過量的MDA極易在動物源性產(chǎn)品中蓄積，最后通過食物鏈進入人體，損害健康。因此，本文結(jié)合國內(nèi)外文獻報道綜述了關(guān)于MDA的理化性質(zhì)、來源、代謝途徑、毒性作用及檢測技術(shù)的研究進展，旨在為揭示油脂酸敗致MDA蓄積引起的健康危害和畜禽生產(chǎn)性能下降作用機制提供參考。

1 丙二醛的理化性質(zhì)

MDA是一種揮發(fā)性短鏈小分子化合物，含兩個結(jié)晶水，呈無色針狀晶體，60℃下真空干燥可得無水物。相對分子量為72.06，熔點72—74℃，水溶液呈弱酸性（pKa＝4.46）。MDA純品在中性條件下穩(wěn)定，在酸性條件下不穩(wěn)定，液態(tài)或氣態(tài)下完全烯醇化，形成穩(wěn)定的烯酸式鹽，如MDA的烯醇式鈉鹽等。

2 丙二醛的來源

工業(yè)生產(chǎn)中，MDA主要由乙醛和甲酸乙酯在堿性條件下縮合而成，并在高壓真空下進一步升華精制，常用作醫(yī)藥中間體、感光色素的原料。在生物體內(nèi)，MDA是二十烷基類物質(zhì)（如：花生四烯酸）酶促降解的副產(chǎn)物，以及多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid，PUFA）氧化降解的中間產(chǎn)物。在花生四烯酸的氧化降解過程中，首先經(jīng)脂肪酸環(huán)化酶催化形成9，11，15-過氧化氫衍生物-前列腺素G2（Prostaglandin G2，PGG2），再由前列腺素過氧化酶催化生成前列腺環(huán)素、前列腺素、血栓烷的活潑中間體-PGH2（Prostaglandin endoperoxide H2），最后在血栓烷合成酶的作用下，約有30%形成MDA［6］。另外，很多學(xué)者認為MDA是PUFA在熱酸或金屬催化下形成的不穩(wěn)定二級產(chǎn)物，推測含有三個或者多個共軛雙鍵的PUFA在氧化過程中形成含有β、γ共軛雙鍵的過氧化氫自由基或形成易氧化、環(huán)基化的含氧橋自由基（含三碳兩氧的五元環(huán)），而后這種過氧化物發(fā)生分子內(nèi)斷裂生成MDA［7］。臭氧、氮氧化物、氧過多和某些外源性物質(zhì)等環(huán)境因素也能促進體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的發(fā)生。此外，高度不飽和酸的累積、維生素E或硒缺乏以及組織損傷等都能誘導(dǎo)金屬催化脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，導(dǎo)致過量的MDA產(chǎn)生［8］。另外，在電離輻射或氧化應(yīng)激條件下，蛋白質(zhì)、核苷酸、糖類等多種非脂類生物分子降解也可產(chǎn)生MDA［9］。

3 丙二醛的代謝轉(zhuǎn)化

在正常飲食或生理狀態(tài)下，會產(chǎn)生較多的內(nèi)源性MDA，但哺乳動物有其完善的MDA促降解途徑，使機體內(nèi)MDA的生成和降解基本保持動態(tài)平衡。MDA的代謝途徑主要包括兩部分：（1）首先MDA衍化生成乙醛，其次在醛降解酶的作用下生成CO2和少量乙酰輔酶A或丙酰輔酶A，CO2直接排出體外，乙酰輔酶A或丙酰輔酶A進入其他代謝循環(huán)，如脂質(zhì)合成途徑。（2）代謝酶直接將MDA及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的其他醛類還原成相應(yīng)的醇，直接解除醛的毒害作用［7］。其他資料顯示，MDA還可通過生成丙二酸鹽類被消耗。此外，由于MDA對酸不穩(wěn)定，其代謝產(chǎn)物中只有極少量以原型分泌到尿液中，大都以N-乙酰-ε（2-丙烯醛基）賴氨酸（簡寫：ε-PL）的形式出現(xiàn)［8］。給大鼠灌胃14C標(biāo)記MDA，12 h后MDA分別經(jīng)CO2、糞便、尿液的排泄量為60%—70%、5%—15%和9%—17%［10］。

4 丙二醛的毒性作用

MDA不僅是生物體氧化應(yīng)激的標(biāo)志物，同時它還具有很強的毒副作用。其毒害機制可能是它易與生物分子中的初級氨發(fā)生非特異性反應(yīng)，導(dǎo)致分子內(nèi)或分子間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)［11］。MDA與核苷酸堿基反應(yīng)形成多種加合物，如M1G、M2G、M1A、M3A、M1C、M3C。這些加合物是由MDA上具有強親電子性的1，3-雙不飽和醛基與親核物質(zhì)如賴氨酸、組氨酸等氨基酸殘基和蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，進而誘導(dǎo)DNA和蛋白功能發(fā)生改變［12-13］。有研究指出，M1G不僅降低DNA的復(fù)制速度，對大腸桿菌也有致突變作用［14］。Chuan等［15］給人類RKO和H1299細胞系添加1 mmol/L的MDA，作用24 h后細胞內(nèi)M1G含量顯著增加，細胞出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的周期停滯。Voitkun等［16］觀察發(fā)現(xiàn)在MDA作用下DNA-組蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，不僅阻礙DNA的正常轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，嚴重時還會導(dǎo)致染色體斷裂、缺失，以及突變和細胞死亡。有報道指出，MDA在體內(nèi)與賴氨酸殘基結(jié)合形成N-ε-（2-丙烯醛基）賴氨酸或1-氨基-3-亞氨基丙烯和吡啶-二氫吡啶化合鍵形成的賴氨酸-賴氨酸交聯(lián)，是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的基礎(chǔ)［17］，同時MDA引起的膠原蛋白分子間的交聯(lián)反應(yīng)，可能是心血管硬化的主要原因［18］。此外，機體內(nèi)過高的MDA還可引發(fā)嚴重的細胞毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性、致突變或致癌變作用等。

4.1 細胞毒性

MDA與核苷酸、蛋白質(zhì)等的親核加成反應(yīng)，是其對活體細胞產(chǎn)生毒害作用的基礎(chǔ)。Yin等［19］研究發(fā)現(xiàn)MDA會攻擊神經(jīng)元細胞功能蛋白，改變蛋白活性，進而影響細胞的正常功能。給三周齡SD大鼠側(cè)腦室注射MDA，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)不同濃度的MDA處理都會對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞內(nèi)線粒體造成不同程度損傷，如線粒體嵴變模糊或消失等，且MDA濃度越高，線粒體損傷越大［2］。其他研究發(fā)現(xiàn)，MDA能引起神經(jīng)元突觸變短、胞體腫脹，抑制質(zhì)膜Ca2+-ATPase活性，破壞神經(jīng)元胞質(zhì)游離Ca2+穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)細胞凋亡或死亡［20］。還有研究表明，MDA還可抑制NADH和琥珀酸呼吸鏈、降低電子傳遞鏈復(fù)合物I、II、V的活性以及腦神經(jīng)元細胞中線粒體膜電位，促進ROS的產(chǎn)生，降低SOD活性和GSH水平，加劇線粒體蛋白質(zhì)的羰基化程度［21］。

MDA對肝細胞的代謝也有影響，用不同濃度MDA體外干預(yù)大鼠肝線粒體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDA對線粒體呼吸鏈及α-酮戊二酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶均有不同程度的影響，且不同酶對MDA的敏感程度不同［22］。體外人骨髓間充質(zhì)干細胞研究顯示，高體積濃度的（10－3mol/L、10－4mol/L）MDA還能使細胞數(shù)減少，群體倍增時間延長，細胞活力降低，凋亡率增加，G2/M期和S期的細胞百分率明顯增加［23］。紅細胞試驗發(fā)現(xiàn)MDA可通過羰基應(yīng)激造成其損傷，并誘導(dǎo)血液粘度增加［24］?？梢姡琈DA主要通過改變蛋白活性、損傷線粒體、抑制膜電位、電子呼吸鏈功能、阻滯細胞周期等作用來誘導(dǎo)細胞凋亡，產(chǎn)生毒害作用。

4.2 神經(jīng)毒性

MDA的神經(jīng)毒性可能是源于對神經(jīng)元細胞功能以及線粒體損傷作用的不斷累積，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞凋亡。Morris水迷宮方法（包括定位航行實驗和空間探索實驗）研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室注射MDA不僅顯著影響SD大鼠的逃避潛伏期，同時還影響對水下平臺所在象限的準(zhǔn)確記憶，顯著降低大鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力［2］。李莉等［1］研究腹腔注射MDA對昆明小鼠體能行為（游泳、爬桿）的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一次性給藥或長期給藥MDA對小鼠的體能影響均達到了顯著水平?？梢?，MDA不僅導(dǎo)致大腦學(xué)習(xí)記憶能力的損傷和衰退，還能影響動物的體能，對生物體的運動機能也具有毒害作用。

4.3 遺傳毒性

MDA的遺傳毒性可能與其和不同核苷酸反應(yīng)形成加合物有關(guān)。Vander等［25］指出MDA能引起基因堿基對置換或移碼突變。其他遺傳毒性試驗表明，MDA不僅能使大鼠皮膚成纖維細胞產(chǎn)生微核，10－4mol/L和10－3mol/LMDA分別處理12 h后可致14%和34%的染色體發(fā)生畸變，24 h后畸變率分別達到46%和52%［26］。Heddle等［27］研究發(fā)現(xiàn)MDA的微核試驗中產(chǎn)生無著絲粒片段，引發(fā)染色體斷裂。同時，在細胞分裂后期MDA能誘導(dǎo)產(chǎn)生滯后染色體，引起主軸異變，使染色體出現(xiàn)不均等分裂?？梢?，MDA的遺傳毒性主要是引起基因突變、微核產(chǎn)生以及染色體畸變等。

4.4 致突變和致癌毒性

早在1976年，Mukai等［28］就用Ames試驗證實了MDA對鼠傷寒沙門氏菌具有致突變作用。隨后，有研究表明20 mM MDA可對淋巴瘤細胞株產(chǎn)生細胞毒性，同時誘導(dǎo)大量的突變體細胞出現(xiàn)［29］。給Fischer大鼠灌胃100 mg/kg MDA鈉鹽兩年，可誘導(dǎo)甲狀腺濾泡細胞癌、胰島細胞腺瘤以及垂體前葉腺癌等發(fā)生，但對B6C3F1小鼠進行類似試驗，卻未觀察到癌變率增加［30］。目前的國內(nèi)外動物試驗數(shù)據(jù)都不足以證明MDA對人體有致癌性，但對胃癌、肝癌、糖尿病和心血管疾病等患者血液中MDA的含量檢測發(fā)現(xiàn)，這些患者體內(nèi)MDA的水平要遠高于正常人群［31］?？梢?，MDA不僅具有致突變作用，長期飼喂高劑量還可能誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生，但對人體的作用還有待進一步試驗研究。

4.5 其他

MDA的其他研究發(fā)現(xiàn)，給8周齡雄性ICR Swiss小鼠灌胃90 d，肝細胞核呈現(xiàn)不規(guī)則，大小不一，染色過深，有的還形成空泡，并且肝臟的病變呈劑量-效益關(guān)系。然而，雌性ICR Swiss小鼠持續(xù)一年通過飲水?dāng)z入0.1 mg/（kg·bw）、1 mg/（kg·bw）、10 mg/（kg·bw）不同劑量的 MDA，其他組織未觀察到任何變化，只有肝臟發(fā)生嚴重損傷、肝臟臟器系數(shù)顯著降低，病理組織學(xué)顯示肝細胞出現(xiàn)結(jié)節(jié)性增生、肝細胞瘤和血管瘤等病變［32］。草魚研究指出，MDA會引起肝胰臟氧化應(yīng)激，并可通過影響細胞線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)來損傷草魚肝胰臟，增加其發(fā)生脂肪性肝炎的機率［3］。故可推斷，肝臟可能是MDA毒性作用的靶器官，因此很有必要對畜禽飼料中油脂的酸敗程度特別是MDA含量開展安全評估工作。

5 丙二醛的暴露現(xiàn)狀

MDA作為脂質(zhì)過氧化主要的產(chǎn)物之一，在酸敗食品中含量很高。根據(jù)美國國家醫(yī)學(xué)圖書館的統(tǒng)計資料顯示，MDA在魚肉、魚油、腐敗的鮭魚油、腐敗的堅果、腐敗面粉、橙汁、植物油、脂類、新鮮的冷凍青豆、牛奶、牛奶脂肪、黑面包、生（熟）肉中都有檢測到。1983年，美國居民從魚和肉類中攝入MDA的日均量為0.2μg和0.6μg［33］。目前，關(guān)于我國居民食用油脂及油脂飼料中MDA的含量檢測報道較少，只有覃勇榮等［34］檢測了桂西北65種常見石山植物葉片中MDA的含量范圍為0.0052—0.0381μmol/g。其他報道只是將MDA作為評判大米陳化，面粉、臘肉、食用油、飼料以及堅果儲存過程中油脂酸敗的一個指標(biāo)，這可能與我國還沒有建立食品以及飼料中MDA安全限量的標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國人民生活水平的逐漸提高，MDA的日攝入量可能增加。高油脂食品作為人體MDA攝入的主要途徑，故對高油脂食品中MDA進行監(jiān)測和開展安全限量研究很有必要。

6 丙二醛的檢測方法

MDA能與核苷酸、蛋白質(zhì)等親核物質(zhì)反應(yīng)，發(fā)生氧化損傷或其他生理作用。在生物和醫(yī)藥科學(xué)中，MDA常作為肝臟和機體等氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物。而在不同種食品，特別是高油脂食品MDA常作為判定油脂酸敗的標(biāo)志物。因此，不斷提升和改進MDA的檢測方法對準(zhǔn)確判斷機體損傷和油脂酸敗具有重要意義。

6.1 比色法

硫代巴比妥酸（TBA）比色法是檢測MDA含量的傳統(tǒng)分析方法。該法利用過氧化降解產(chǎn)物中的MDA與硫代巴比妥酸（TBA）在高溫（80—100℃）和酸性條件下以1∶2的比例縮合，形成的紅色的MDA-TBA加合物，于532 nm處有最大吸收峰來進行測定［35］。此方法的優(yōu)點是儀器簡單，易于快速操作、簡便、成本低廉，從而被廣泛采用。而比色法的缺點是靈敏度低、選擇性不強，常出現(xiàn)假陽性。這主要是由于在高溫、酸性條件下，不僅MDA會與TBA反應(yīng)，脂類氧化產(chǎn)生的其他醛類物質(zhì)也能與TBA發(fā)生反應(yīng)。因此，TBA與MDA的反應(yīng)不具有特異性。

6.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法是定量分析MDA的方法，可實現(xiàn)MDA的定性、定量、確證同時進行。為了取得理想的檢測效果，常需綜合考慮流動相、色譜柱、柱溫和檢測器等條件，優(yōu)化最佳配比。課題組前期工作中已采用高效液相色譜法（HPLC）及熒光檢測器建立了飼料中MDA的檢測方法，并制定了國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 28717—2012。該方法的檢測限為0.015 mg/kg，定量限為0.05 mg/kg［36］。跟比色法相比，該方法特異性高、靈敏度強。然而，該法也存在諸多不足，如檢測器靈敏度有限，耗時長，回收率和分子組分會受環(huán)境因素影響等。

6.3 其他方法

孔汶汶等［37］開拓性的應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)實現(xiàn)了除草劑脅迫下大麥葉片中MDA的簡便、無損和快速檢測。其他研究還開展了MDA的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）等。如 Shin等［38］用 GC-MS法檢測人體尿液中MDA的檢測限為0.04μg/L。Syslová等［39］在用LC-MS/MS分析哈氣中的MDA含量，檢測限可低至0.032μg/L。這些技術(shù)增強了MDA檢測的靈敏度和特異性，但由于儀器設(shè)備昂貴、樣品需要衍生化等要求限制了方法的廣泛應(yīng)用。

7 結(jié)論

隨著人類對精密儀器和分子生物學(xué)的研究，將會進一步揭示MDA毒性作用的機理，并提出更高靈敏度和特異性的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)。然而目前國內(nèi)外對MDA的毒理試驗研究還較少。隨著人類飲食習(xí)慣、膳食結(jié)構(gòu)的變化，現(xiàn)代社會人們對油脂類食品的攝入量日益增加，MDA作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物有生物毒性，有對人體健康造成危害的潛在性。因此，對高油脂食品中MDA的毒理試驗研究很有必要，這也將給MDA的進一步風(fēng)險評估提供數(shù)據(jù)。

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